SN/T 5145.1-2019 相关标准英文版PDF
| 标准号码 | 价格美元 | 第2步(购买) | 交付天数 | 标准名称 |
| SN/T 5145.1-2019 | 219 | SN/T 5145.1-2019 | [PDF]天数 <=3 | 出口食品及饲料中动物源成分快速检测方法 第1部分：猫成分检测 PCR-试纸条法 |
| 基本信息 | |
|---|---|
| 标准编号 | SN/T 5145.1-2019 (SN/T5145.1-2019) |
| 中文名称 | 出口食品及饲料中动物源成分快速检测方法 第1部分：猫成分检测 PCR-试纸条法 |
| 英文名称 | Rapid ldentifieation of animal ingredient in export food and feed -- Part 1: Detection of Felinae Ingredient PCR-Lateral flow dipstick method |
| 行业 | 商检行业标准 (推荐) |
| 中标分类 | C53 |
| 国际标准分类 | |
| 字数估计 | 10,112 |
| 发布日期 | 2019-10-25 |
| 实施日期 | 2020-05-01 |
| 标准依据 | 海关总署公告2019年第166号 |
| 发布机构 | 海关总署 |
SN/T 5145.1-2019: 出口食品及饲料中动物源成分快速检测方法 第1部分：猫成分检测 PCR-试纸条法
SN/T 5145.1-2019 英文名称: Rapid ldentifieation of animal ingredient in export food and feed -- Part 1: Detection of Felinae Ingredient PCR-Lateral flow dipstick method
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
出口食品及饲料中动物源成分快速
检测方法 第１部分：猫成分检测PCR-试纸条法
中华人民共和国海关总署 发 布
前言
ＳＮ/T ５１４５《出口食品及饲料中动物源成分快速检测方法》分为以下１３个部分：
---第１部分：猫成分检测 ＰＣＲ-试纸条法；
---第２部分：貂成分检测 ＰＣＲ-试纸条法；
---第３部分：鹿成分检测 ＰＣＲ-试纸条法；
---第４部分：骆驼成分检测 ＰＣＲ-试纸条法；
---第５部分：狗成分检测 ＰＣＲ-试纸条法；
---第６部分：牛成分检测 ＰＣＲ-试纸条法；
---第７部分：绵羊成分检测 ＰＣＲ-试纸条法；
---第８部分：驴成分检测 ＰＣＲ-试纸条法；
---第９部分：狐狸成分检测 ＰＣＲ-试纸条法；
---第１０部分：鹅成分检测 ＰＣＲ-试纸条法；
---第１１部分：鸭成分检测 ＰＣＲ-试纸条法；
---第１２部分：火鸡成分检测 ＰＣＲ-试纸条法；
---第１３部分：鸽子成分检测 ＰＣＲ-试纸条法；
本部分是ＳＮ/T ５１４５的第１部分。
本部分按照GB/T １．１-２００９给出的规则起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。
本部分由中华人民共和国海关总署提出并归口。
本部分起草单位：中华人民共和国天津海关，天津师范大学，中华人民共和国北京海关，北京华大蛋
白质研发中心有限公司。
本部分主要起草人：郑文杰、张宏伟、马丹、赵良娟、李宗梦、张霞、刘伟、孙金生、尹长城。
SN／T５１４５．１-２０１９
出口食品及饲料中动物源成分快速
检测方法 第１部分：猫成分检测PCR-试纸条法
１ 范围
本部分规定了食品及饲料中猫源性成分检测的ＰＣＲ-试纸条方法。
本部分适用于肉、肉制品及饲料中猫源性成分的定性检测。
２ 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本
文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T ６６８２ 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T １４６９９．１ 饲料 采样
GB/T ２７４０３-２００８ 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测
４ 方法原理
利用裂解液破碎样本细胞，苯酚-氯仿法抽提基因组ＤＮＡ，以提取的ＤＮＡ为模板，采用上游和下游
引物分别经异硫氰酸盐（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ５-ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ，ＦＩＴＣ）和生物素（Ｂｉｏｔｉｎ）标记进行ＰＣＲ扩增，获
得两端分别带有异硫氰酸盐和生物素分子的ＰＣＲ产物。用含有金标记的抗异硫氰酸盐的兔多克隆抗
体和固定有链亲和素的通用核酸检测试纸条对ＰＣＲ产物进行筛选检测，并对ＰＣＲ阳性产物进行测序
确证。
５ 试剂和材料
除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB/T ６６８２的要求。
５．１ 猫源性成分检测用引物（对）序列及标记物为：
猫成分扩增引物详见表１。
５．２ 试剂
５．２．１ ＥｘＴａｑＨｏｔＳｔａｒｔＤＮＡ聚合酶（Ｔａｑ，Ｔｅｒｍｕｓａｕａｔｉｃｕ）。
５．２．２ ｄＮＴＰｓ：ｄＡＴＰ（ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ，脱氧腺苷三磷酸）、ｄＴＴＰ（ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅ
ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ，脱氧胸苷三磷酸）、ｄＣＴＰ（ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅｃｙｔｉｄｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ，脱氧胞苷三磷酸）、
ｄＧＴＰ（ｄｅｏｘｙｇｕａｎｎｏｓｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ，脱氧鸟苷三磷酸）。
５．２．３ １０×ＰＣＲ缓冲液：２００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ８．４），２００ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ，２０ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２。
５．２．４ 三氯甲烷（氯仿）。
５．２．５ 异丙醇。
５．２．６ ＣＴＡＢ提取液：２０ｇ／ＬＣＴＡＢ，１．４ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，０．１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ-ＨＣｌ，０．０２ｍｏｌ／ＬＮａ２ＥＤＴＡ，ｐＨ
８．０。
５．２．７ ＣＴＡＢ沉淀液：５ｇ／ＬＣＴＡＢ，４０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，ｐＨ８．０。
５．２．８ 酚／三氯甲烷／异戊醇溶液：按照Ｔｒｉｓ饱和酚：三氯甲烷：异戊醇溶液体积比为２５∶２４∶１进行
配制。
５．２．９ 三氯甲烷／异戊醇溶液：按照三氯甲烷：异戊醇溶液体积比为２４∶１进行配制。
５．２．１０ ７０％乙醇（Ｖ／Ｖ）。
５．２．１１ ＮａＣｌ溶液（１．２ｍｏｌ／Ｌ）。
５．２．１２ 蛋白酶Ｋ（２０ｍｇ／ｍＬ）。
５．２．１３ 试纸条：含有金标记的抗异硫氰酸盐的兔多克隆抗体和固定有链亲和素的通用核酸检测试纸
条，可通过采购的原料试剂自行组装（参见附录Ａ）或采用等效的商品化试纸条。
５．２．１４ 展开液：１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ、１％ＢＳＡ、１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０以及浓度为０．０５ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ；或采
用等效的商品化产品。
６ 仪器设备
６．１ 离心机（离心力≥１２０００ｇ），４℃±１℃。
６．２ 微量移液器（１００μＬ～１０００μＬ，２０μＬ～２００μＬ，２μＬ～２０μＬ，０．５μＬ～１０μＬ）。
６．３ ＰＣＲ仪。
６．４ 恒温水浴锅，６５℃±１℃。
６．５ 天平：感量０．０１ｇ。
６．６ ｐＨ计。
６．７ 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计
７ 检验步骤
７．１ 样品制备
７．１．１ 食品
将固状待检样品研磨混匀，分装三份，其中一份为检样，另外两份为留存样品。液状样品直接分装。
加工食品可能富含盐、糖、植物色素和发酵产生的有色物质等，会影响下游实验操作，应通过洗涤方
式尽量去除样品中的盐、糖和色素等杂质。
７．１．２ 饲料
饲料样品按照GB/T １４６９９．１采样，或若粒度为２０目称取２００ｍｇ，６０目称取１００ｍｇ，１００目称取
１００ｍｇ。
７．２ 样品DNA提取
称取１００ｍｇ样品于２ｍＬ离心管中，加入１ｍＬＣＴＡＢ提取液，加入１０μＬ２０ｍｇ／ｍＬ蛋白酶Ｋ，
６５℃温育１ｈ，期间不时震荡混匀，应保证样品自由悬浮于液体中，必要时再加入适量ＣＴＡＢ提取缓冲
液；取出后１２０００ｇ离心１０ｍｉｎ，转移上清至２ｍＬ离心管中，加入等体积的室温酚／三氯甲烷／异戊醇
（２５∶２４∶１）颠倒混匀，１２０００ｇ转速下离心１０ｍｉｎ；转移上清至另一灭菌的离心管中，加入等体积的三
氯甲烷／异戊醇（２４∶１），颠倒混匀，室温下１２０００ｇ离心１０ｍｉｎ；转移上清至干净离心管中，加入等体
积的ＣＴＡＢ沉淀液混匀，室温沉淀１ｈ；加入０．８倍体积的异丙醇或２倍体积-２０℃冰箱中预冷的无水
乙醇混匀，-２０℃放置３０ｍｉｎ，１２０００ｇ４℃离心１０ｍｉｎ，弃上清，用７０％乙醇洗涤沉淀一次，１２０００ｇ
４℃离心１０ｍｉｎ，弃上清，室温下晾干。加入５０μＬ双蒸水，室温１０ｍｉｎ，混匀，-２０℃保存。上述方法可用等效ＤＮＡ提取试剂盒提取模板ＤＮＡ。
７．３ DNA浓度和纯度的测定
取５μＬＤＮＡ溶液加双蒸水稀释至１ｍＬ，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测２６０ｎｍ和２８０ｎｍ处的吸光值Ａ２６０和Ａ２８０。ＤＮＡ的浓度按式（１）计算：
７．４ PCR扩增
７．４．１ PCR反应体系
见表２。
７．４．２ 反应条件
９４℃ 预变性５ｍｉｎ；９４℃ 变性３０ｓｅｃ，５５℃退火３０ｓｅｃ，７２℃延伸３０ｓｅｃ，３０个循环后进入７２℃
５ｍｉｎ。ＰＣＲ反应条件随不同的ＰＣＲ仪略有改变。
检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。用已知含猫源性成分的样品作阳性对照，用已
知不含猫源性成分的样品作阴性对照，用等体积的双蒸水代替模板ＤＮＡ作空白对照。
７．４．３ 试纸条检测
取５μＬＰＣＲ产物点于核酸试纸条样品垫，加入到９５μＬ展开液中进行检测，５ｍｉｎ后观察结果。
８ 质量控制
以下条件有一条不满足时，实验视为无效：
ａ） 空白对照：质控线变红，检测线未变红。
ｂ） 阴性对照：质控线变红，检测线未变红。
ｃ） 阳性对照：质控线变红，检测线变红。
９ 结果判断与报告
９．１ 结果判定
试纸条质控线变红色，且检测线......