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| 标准编号 | GB 4789.44-2020 (GB4789.44-2020) | | 中文名称 | 食品安全国家标准 食品微生物学检验 创伤弧菌检验 | | 英文名称 | National food safety standard - Food microbiological examination - Vibrio vulnificus | | 行业 | 国家标准 | | 中标分类 | X09 | | 字数估计 | 17,192 | | 发布日期 | 2020-09-11 | | 实施日期 | 2021-03-11 | | 标准依据 | 国家卫生健康委员会 国家市场监督管理总局公告2020年第7号 | GB 4789.44-2020: 食品安全国家标准 食品微生物学检验 创伤弧菌检验
GB 4789.44-2020 英文名称: National food safety standard - Food microbiological examination - Vibrio vulnificus
1 范围
本标准规定了水产品中创伤弧菌(Vibriovulnificus)的检验方法。
本标准适用于鱼、虾、蟹、贝类等水产品中创伤弧菌的检验。
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
2.1 恒温培养箱:36℃±1℃。
2.2 冰箱:2℃~5℃、7℃~10℃。
2.3 恒温水浴锅。
2.4 均质器或无菌研钵。
2.5 天平:感量0.1g。
2.6 PCR仪。
2.7 电泳仪或毛细管电泳仪。
2.8 凝胶电泳成像系统或紫外检测仪。
2.9 生物安全柜。
2.10 高速离心机(最大转速至少15000r/min)。
2.11 涡旋振荡器。
2.12 微量可调移液器(量程2.5μL、10μL、100μL、1000μL)及配套吸头。
2.13 精密pH试纸或pH计。
2.14 无菌试管:规格18mm×180mm和15mm×100mm。
2.15 无菌吸管:规格1mL(具0.01mL刻度)和10mL(具0.1mL刻度)。
2.16 无菌锥形瓶:容量250mL、500mL和1000mL。
2.17 无菌培养皿:直径90mm。
2.18 无菌手术剪、镊子、钳子等。
2.19 PCR反应管。
3 培养基和试剂
3.1 蛋白胨-氯化钠-纤维二糖-多黏菌素E(PNCC)增菌液:见A.1。
3.2 纤维二糖-多黏菌素E(CC)琼脂培养基:见A.2。
3.3 改良纤维二糖-多黏菌素B-多黏菌素E(mCPC)琼脂培养基:见A.3。
3.4 3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂培养基:见A.4。
3.5 磷酸盐缓冲液(PBS):见A.5。
3.6 3%氯化钠三糖铁琼脂斜面:见A.6。
3.7 嗜盐性试验培养基:见A.7。
3.8 3%氯化钠赖氨酸脱羧酶试验培养基:见A.8。
3.9 3%氯化钠 MR-VP培养基:见A.9。
3.10 3%氯化钠溶液:见A.10。
3.11 氧化酶试剂:见A.11。
3.12 革兰氏染色液:见A.12。
3.13 邻硝基酚-β-D-半乳糖苷(ONPG)试剂:见A.13。
3.14 Voges-Proskauer(V-P)试剂:见A.14。
3.15 细菌DNA提取试剂盒。
3.16 生化鉴定试剂盒。
3.17 PCR反应配套试剂。
3.18 琼脂糖凝胶电泳配套试剂。
3.19 具有菌种保藏资质单位提供的创伤弧菌标准菌株。
4 检验程序
5 操作步骤
5.1 样品制备
5.1.1 新鲜样品采集后应于3h内完成检验,若不能在规定时间内完成,则将样品置于7℃~10℃条
件下保存(因创伤弧菌在4℃条件下极易形成活而不可培养的状态,因此样品勿放4℃条件下),并尽可能在24h内完成检验;冷冻样品应在不超过45℃的温热条件下解冻,解冻时间不超过15min。
5.1.2 取样:鱼类和头足类取其表面组织、肠和鳃。贝类则取全部内容物(包括贝肉和体液)。甲壳类取整个动物或其中心部分(包括肠和鳃)。如为带壳贝类或硬壳甲壳类,则应先用流动自来水冲洗外壳并用滤纸吸干表面水分,然后无菌操作打开外壳,按上述要求取相应部分。
5.1.3 以无菌操作取上述处理后的样品25g,加入PNCC增菌液225mL,用旋转刀片式均质器以
8000r/min均质1min,或用拍击式均质器均质2min,充分混匀制备成1∶10的样品匀液。如无均质
器,则将样品放入无菌乳钵中充分研磨,取磨碎后的样品25g转入500mL无菌锥形瓶中,加入PNCC
增菌液225mL,充分振荡混匀,制备成1∶10的样品匀液。
5.2 增菌
将5.1.3制备的1∶10样品匀液于36℃±1℃培养18h±1h。
5.3 PCR检测
PCR实验环境条件和过程控制应参照GB/T 27403《实验室质量控制规范 食品分子生物学检
测》规定执行,下同。
5.3.1 DNA模板的制备
在距离PNCC增菌液的液面下1cm处吸取1mL置于1.5mLEP管中,9000r/min离心3min,
弃去上清液。向沉淀中加入1mLPBS将其悬浮并充分清洗后,9000r/min离心3min,弃去上清液,
按此步骤反复清洗沉淀2次~3次,弃去最后一遍上清液,加入1mL无菌超纯水,100℃煮沸10min,
继而12000r/min离心5min,上清液用于PCR分析。若不能及时分析则于-20℃保存备用。
也可以用商品化的DNA提取试剂盒按其说明书要求提取制备DNA模板。
5.3.2 PCR扩增
5.3.2.1 引物
信息见表1。
5.3.2.2 对照设置
每次PCR反应使用创伤弧菌标准菌株作为阳性对照,同时,使用除创伤弧菌之外的其他弧菌的标
准菌株作为阴性对照,以灭菌去离子水作为空白对照。
5.3.2.3 PCR反应体系
5.3.2.4 PCR反应程序
预变性:94℃、5min;变性:94℃、1min;退火:62℃、1min;延伸:72℃、1min;循环数:30;终延
伸:72℃、10min;电泳检测。若不能立即检测则4℃保存备用。
5.3.3 电泳
凝胶电泳检测PCR扩增产物。用0.5×TBE缓冲液配制1.5%的琼脂糖凝胶(含EB0.5μg/mL或
Goldview5μL/100mL或Gelred5μL/50mL等DNA染料),取5μLPCR扩增产物与1μL6×核酸
电泳上样缓冲液混合后,点样,同时有一孔加入DNA分子量标准(范围为100bp~1000bp)。根据以
下公式:电泳槽正负极的距离(cm)×5V/cm计算并设置电压,使用0.5×TBE缓冲液恒压电泳,根据
溴酚蓝的移动位置确定电泳时间,使用凝胶成像系统或紫外检测仪观察和记录结果。
5.3.4 结果判定
质控系统:阴性对照和空白对照均未出现扩增条带,阳性对照出现预期大小(519bp)的扩增条带,
则检测系统正常。否则,任一种对照如果出现非上述正常结果,应重做实验,同时排除污染因素。
阳性结果:在质控系统正常的情况下,待测样品出现预期大小(519bp)的扩增条带,判定PCR结果
为阳性。
阴性结果:在质控系统正常的情况下,待测样品未出现预期大小(519bp)的扩增条带,判定PCR结
果为阴性。
5.4 分离
用10μL接种环在距离PNCC增菌液的液面下1cm 沾取一环增菌液,分别划线接种于CC和
mCPC平板,于36℃±1℃条件下培养18h±1h。典型的创伤弧菌在CC和mCPC平板上的形态为:
圆形、扁平,光照下呈透明或中心不透明但边缘透明的黄色至橘黄色菌落,菌落直径1mm~2mm,菌
落周围可出现(或不出现)黄色晕圈。
5.5 分纯培养
从CC平板和mCPC平板上各挑取至少5个创伤弧菌可疑菌落(少于5个时全选),分别接种于
3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板,36℃±1℃培养18h±1h后用于后续鉴定。创伤弧菌在3%氯化
钠胰蛋白胨大豆琼脂平板上的菌落形态为圆形、乳白色、湿润、隆起、直径1mm~2mm。
5.6 鉴定
创伤弧菌可采用菌落特征结合生化特性或PCR方法进行鉴定。
5.6.1 菌落特征及生化特性
5.6.1.1 初步鉴定
该步骤用于创伤弧菌的初步鉴定,进行以下4项鉴定实验时,挑取的菌落应来自分纯后的同一个单
菌落。
a) 革兰氏染色镜检:从5.5中3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板上挑取创伤弧菌疑似菌落进行革
兰氏染色并镜检。创伤弧菌为革兰氏阴性,显微镜下菌体为棒状、弧状、卵圆状等多种形态,无
芽胞。
b) 氧化酶试验:用接种环从5.5中3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板上挑取创伤弧菌疑似菌落适
量,涂布在用氧化酶试剂润湿(如无菌滤纸)或滴有氧化酶试剂的白色或无色载体上(如载玻
片)。如果涂菌部位在10s之内变紫色(偶有蓝紫色),即为氧化酶试验阳性,不变色为氧化酶
试验阴性。创伤弧菌为氧化酶试验阳性。
c) 三糖铁试验:用接种针从5.5中3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板上挑取创伤弧菌疑似菌落适
量,转种于3%氯化钠三糖铁琼脂斜面并穿刺底层(注意接种针不要触及试管底部),36℃±
1℃培养24h观察结果。创伤弧菌在3%氯化钠三糖铁琼脂斜面中生长时试管底层变黄,无
气泡,斜面颜色不变黄(偶有斜面颜色变黄现象)。......
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