搜索结果: GB/T 39104.1-2020, GB/T39104.1-2020, GBT 39104.1-2020, GBT39104.1-2020
| 标准编号 | GB/T 39104.1-2020 (GB/T39104.1-2020) | | 中文名称 | 纺织品 抗真菌性能的测定 第1部分：荧光法 | | 英文名称 | Textiles - Determination of antifungal activity of textile products - Part 1: Luminescence method | | 行业 | 国家标准 (推荐) | | 中标分类 | W04 | | 国际标准分类 | 59.080.01 | | 字数估计 | 22,224 | | 发布日期 | 2020-10-21 | | 实施日期 | 2021-05-01 | | 发布机构 | 国家市场监督管理总局、中国国家标准化管理委员会 | GB/T 39104.1-2020
Textiles -- Determination of antifungal activity of textile products -- Part 1: Luminescence method
ICS 59.080.01
W04
中华人民共和国国家标准
纺织品 抗真菌性能的测定
第1部分:荧光法
(ISO 13629-1:2012,MOD)
2020-10-21发布
2021-05-01实施
国 家 市 场 监 督 管 理 总 局
国 家 标 准 化 管 理 委 员 会 发 布
纺织品 抗真菌性能的测定
第1部分:荧光法
1 范围
GB/T 39104的本部分规定了通过检测酶反应[三磷酸腺苷(ATP)法]所产生的荧光强度测定纺织
品抗真菌性能的定量试验方法。
本部分适用于各类纺织品,如纤维、纱线、织物、服饰、床上用品、家居装饰用品及其他纺织产品。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 20944.2-2007 纺织品 抗菌性能的评价 第2部分:吸收法
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
对照样 controlfabric
用于验证试验真菌生长条件的织物。
注:对照样可采用与试样材质相同但未经过抗真菌整理的纺织品。如果无法获得上述试样,用不含荧光增白剂及
未经整理的100%棉织物作为对照样,使用前按GB/T 8629规定在60℃、不添加任何洗涤剂或增白剂的条件
下循环洗涤10次,每个循环洗涤10min,漂洗2次共5min。
3.2
抗真菌剂 antifungalagent
抑制或减缓真菌生长或减少真菌数量的助剂。
3.3
抗真菌整理 antifungaltreatment
抑制或缓和真菌生长或降低真菌数量的整理。
3.4
孢子悬液 sporesuspension
在含阴离子表面活性剂的无菌水中均匀分散有真菌孢子的液体。
3.5
活真菌中存在的一种多功能核苷酸。
3.6
抗真菌性 antifungalactivity
抑制或减缓真菌生长的性能,用对照样和试样中ATP的对数所表示的增长值之差来表征。
3.7
荧光法 luminescencemethod
测定真菌细胞中ATP数量的方法。
注:结果用ATP的摩尔数来表示。
4 原理
将试样和对照样分别用试验真菌孢子悬液接种,并在25℃条件下培养42h。通过比较试样与对照
样上真菌细胞内ATP荧光强度的测定结果,对真菌增长值或抗真菌性能进行定量测定。
5 安全措施
本方法需要使用真菌,应由经过微生物学技术培训和具有经验的人员进行试验。应遵循国家有关
的法规、条例以及与适当的安全预防措施相关的推荐性规范。
6 试验真菌
试验用真菌菌株应从附录A的表A.1中选取。
经有关方同意后可使用加入世界菌种保藏联合会(WFCC)的其他菌种保藏机构提供的等效真菌菌
株代替。
真菌菌株保藏编号和来源应在报告中说明。
7 仪器设备
实验室常规器具及下列仪器。
7.1 纱布:生化试验用或玻璃棉(FR规格)。
7.2 培养皿:内径约90mm和55mm~60mm。
7.3 干燥灭菌器:温度能保持在160℃~180℃。
7.4 高压灭菌锅:温度能保持在(121±2)℃(压强相当于103kPa)。
7.5 二级生物安全柜:或其他等效设备。
7.6 铂接种环:环直径为2mm~4mm。
7.7 L型铂接种钩。
7.8 培养箱:温度能保持在20℃~37℃,允差为±2℃。
7.9 螺口玻璃瓶:容量为30mL,带有聚四氟乙烯或硅橡胶垫片和聚丙烯盖。
7.10 玻璃棒:直径为5mm~18mm,质量为1g~50g。
7.11 玻璃漏斗。
7.12 移液管:容量为0.05mL、0.1mL、0.2mL、1mL、5mL和10mL,允差为5.0%。
7.13 巴斯德吸管:用于微生物试验。
7.14 锥形瓶:容量为100mL~500mL。
7.15 镊子。
7.16 塑料试管:用于光度计。
7.17 试管振荡器。
7.18 离心机:离心加速度约为2000×g。
7.19 离心管:用于离心分离。
7.20 血球计数板:能计测1×106CFU/mL~3×106CFU/mL。
7.21 显微镜:放大倍数为200倍。
7.22 超声波清洗机:试验用紧凑型,频率约为30kHz~50kHz。
7.23 光度计:测试波长为300nm~650nm,在8.4和第11章规定的分析条件下能测定浓度为
1×10-8mol/L~1×10-5mol/L的ATP。
7.24 pH计:在25℃时,精度为±0.1。
7.25 冰箱:温度能保持在2℃~10℃。
7.26 冷冻柜:一个可调节至-80℃以下,另一个可调节至-20℃以下。
试管、玻璃瓶、烧瓶、移液管以及镊子应用碱性或中性洗涤剂小心清洗、冲洗并干燥,并在使用前用
干燥灭菌器或高压蒸汽灭菌器进行处理。
8 试剂和培养基
8.1 通用
试验所用试剂应是分析纯的和/或是适用于微生物试验用的。
宜使用现有商业化的脱水产品制备培养基,并严格按照相关产品制造商的使用说明进行操作。
8.2 纯水
用于制备微生物培养基和试剂的分析级纯水,用蒸馏、离子交换、超滤和/或反渗(RO)装置过滤的
方法制取,应无毒或无抑菌物质。
8.3 阴离子表面活性剂
琥珀辛酯磺酸钠,用于制备孢子悬液。
8.4 荧光剂、试剂和缓冲液
8.4.1 通用
按8.4.2~8.4.8规定配制试剂和缓冲液。可用经过适当验证的商业试剂代替。
8.4.2 ATP标准储备溶液(1×10-3mol/L),以下简称标准ATP溶液
腺嘌呤核苷-5'-三磷酸酯二钠盐三水合物 60.5mg
纯水(8.2) 100mL(最终定容至)
将配制好的标准原液放入密封装置中并在不高于-20℃的条件下冷藏,保质期6个月。
注:不宜复冻和/或重复使用融化后的原液。
8.4.3 ATP荧光剂缓冲液
N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸 1117mg
乙二胺四乙酸二钠盐 183mg
乙酸镁(四合水) 808mg
DL-二硫苏糖醇 6.7mg
糊精 25000mg
蔗糖 925mg
纯水 250mL(最终定容至)
pH 7.5±0.2
8.4.4 ATP荧光剂
在8.4和第11章规定的试验条件下,ATP荧光剂应能使光度计(7.23)检测浓度为1×10-8mol/L~
1×10-5mol/L的ATP。
荧光素酶 0.7mg
D-荧光素 12.6mg
牛血清白蛋白 56mg
缓冲液(见8.4.3) 30mL
一次完全溶解,在使用前置于室温中15min。制备后在3h内使用。
8.4.5 ATP萃取剂
ATP萃取剂应具有从培养真菌中萃取细胞内的ATP的能力,萃取率不低于80%。
N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸 45mg
苯扎氯铵,10%水溶液 0.2mL
纯水 9.8mL
pH(使用氢氧化钠调节pH) 12.0±0.5
如果在萃取液中使用除上述成分的其他试剂应在报告中记录。
8.4.6 ATP消除剂
当在SDB(8.5.2)中加入其1/10体积的ATP消除剂时,应在15min内将培养基中的ATP浓度降
低到10-11mol/L以下。制备后在8h内使用。
成分如下:
三磷酸腺苷双磷酸酶(EC:3.6.1.5) 4.6IU/mL
腺苷酸脱氨酶(EC:3.5.4.6或3.5.4.17) 46IU/mL
蔗糖 37mg
牛血清白蛋白 20mg
0.05mol/L2-吗啉乙磺酸一水合物缓冲液 10mL
pH 6.0±0.5
如果使用其他消除剂,应在报告中记录其成分。
8.4.7 生理盐水溶液
将8.5g氯化钠加入盛有1000mL纯水的烧瓶中。使其完全溶解并根据蒸汽压力灭菌的需要分
装到试管中。
8.4.8 含阴离子表面活性剂的无菌水
将50mg阴离子表面活性剂溶解到纯水中,定容至1000mL,并根据高压蒸汽灭菌的需要分装到
试管中。
8.5 培养基
8.5.1 通用
使用按8.5.2~8.5.5制备的培养基。经验证后可用商业培养基代替。
对于制备后不立即使用的培养基,宜在5℃~10℃条件中储存,保质期1个月。
8.5.2 沙氏葡萄糖肉汤(SDB)
蛋白胨 10g
葡萄糖 20g~40g
纯水 1000mL(最终定容至)
灭菌后pH 5.6±0.2
8.5.3 马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)
将马铃薯洗净去皮,去除每个芽周围约10mm的部分,尽量减少瑕疵,并将其切成10mm的块状。
取200g马铃薯在1000mL纯水中沸煮1h。用多层纱布(7.1)过滤,取滤液加入纯水,定容至1000mL。
加入20g葡萄糖和15g~20g琼脂,待固体充分溶解后放入高压灭菌锅(7.4)中灭菌。
8.5.4 斜面培养基
将10mL完全溶解并预热后的PDA(8.5.3)倒入试管中。用棉塞封口并用蒸汽灭菌。将灭菌后的
试管放置在与试验台平面呈15°倾角的斜面上,并使试管内的物体凝固。当固化琼脂中无流动液体时,
再次溶解并固化以备使用。
8.5.5 沙氏葡萄糖琼脂(SDA)
肉蛋白胨 10g
葡萄糖 35g
琼脂 15g
纯水 1000mL(最终定容至)
按照供应商说明进行。
灭菌后pH 5.6±0.2
注:本培养基可能会用于转移法。
9 真菌的保存与使用
9.1 真菌的保存
在二级生物安全柜(7.5)或其他等效设备中对试验真菌与孢子进行传代培养和操作:
---在传代培养前后对棉塞及试管颈部进行火焰灭菌或化学灭菌。
---刮取原始菌上的一部分菌,以直线或曲线的形式(见图1)将孢子分散在斜面培养基底部的冷
凝水中并涂抹到斜面培养基顶部。
---每次对不同类型的真菌进行传代培养时,使用经火焰灭菌后的铂接种环(7.6)或L型铂接种钩
(7.7)进行接种。
---将传代培养斜面培养基在25℃±2℃条件下的培养箱(7.8)中放置至少8d,并确认在5℃~
10℃条件下保存前已经产生足够的孢子。
---在3个月内,将传代培养的真菌转移到新斜面培养基中,以便进一步培养和保存。
---每3个月传代一次。传代培养的真菌菌落传代次数最多应不超过5次。不要使用超过3个月
的真菌做进一步传代培养。
注:在-80℃冷冻干燥条件下可进行长期保存。
10.2 在培养基中悬浮孢子
步骤如下:
---用短巴斯德吸管(7.13)或等效装置吸取0.5mL含阴离子表面活性剂的无菌水(8.4.8)(步骤1);
---分5次将其分散到琼脂平板中心的孢子中,缓慢清洗表面(步骤2)。
注:微小的调整是可接受的,如增加洗涤水的用量。在这种情况下,保留对所有条件的记录。
10.3 从培养基中收集和分散孢子悬液
步骤如下:
---用短巴斯德吸管(7.13)或类似装置吸取10.2中孢子悬液;
---将其移入约5mL含阴离子表面活性剂的无菌水(8.4.8)中;
---吸吹100次或用试管振荡器搅拌或用低超声波清洗5min,以便孢子能充分分散;
---目测悬液出现轻微浑浊(步骤3)。
10.4 过滤去除菌丝和孢子丝
用带有纱布(7.1)或玻璃棉的漏斗或其他装置进行过滤(步骤4)。
注:纱布(7.1)或玻璃棉尺寸可为5cm×5cm,铺设4层±1层。
10.5 使用离心分离和再悬浮去除上清液
步骤如下:
---过滤后,在25℃±2℃条件下以2000×g加速度离心分离5min,当离心机(7.18)无控温装
置时可在室温下进行;
---移除上清液;
---加入5mL含阴离子表面活性剂的无菌水(8.4.8);
---充分吸吹使孢子分散或使用试管振荡器搅拌,或用低超声波清洗5min,以便于孢子能充分分
散(步骤5)。
10.6 孢子悬液浓度的确认
用血球计数板检验以下项目:
a) 孢子数量及形态:确保孢子数量为1×106CFU/mL~3×106CFU/mL,且90%以上为无菌丝
单孢子;
b) 当孢子数量较多时:用含阴离子表面活性剂的无菌水(8.4.8)稀释悬液,使孢子数量降至1×
106CFU/mL~3×106CFU/mL,并再次检查孢子数量;
c) 当孢子数量不足时:重复离心分离去除上清液,并用含阴离子表面活性剂的无菌水(8.4.8)调
节孢子数量至1×106CFU/mL~3×106CFU/mL,再次检查孢子数量;
d) 对于12.1.3中的转移法,孢子数量应调节至1×108CFU/mL~3×108CFU/mL,该浓度的孢
子悬液应用于试验。
10.7 试验用孢子悬液的调节
步骤如下:
---用含5%SDB的阴离子表面活性剂溶液将孢子悬液浓度调至1×105CFU/mL~3×105CFU/mL
以备试验;
注:如制备100mL含5%SDB的阴离子表面活性剂溶液:在95mL按8.4.8制备的含阴离子表面活性剂的无菌水
中加入5mL按8.5.2制备的SDB培养基。
---稀释时充分搅拌孢子悬液;
---在3℃~4℃条件下冷藏孢子悬液,并在4h内使用。
11 制作ATP校准曲线
ATP校准曲线的制作过程如下(曲线应在试验当天绘制):
a) 用纯水稀释8.4.2中的 ATP标准储备溶液,以制备准确浓度分别为1×10-8 mol/L、1×
10-7mol/L和1×10-6mol/L的3个稀释度;
b) 按以下步骤制备初次稀释ATP试剂:从每个稀释原液中取0.1mL转移到不同的塑料试管,
随后在每个塑料试管中加入0.05mL纯水和0.35mL生理盐水溶液并摇匀;
c) 按以下步骤制备二次稀释 ATP试剂:从初次稀释 ATP试剂中取0.1mL加入试管,并加入
0.4mL生理盐水溶液并摇匀;
d) ATP稀释样的测试准备:从二次稀释 ATP试剂中取0.1mL加入到两个塑料试管中以备
ATP稀释样检测用;
e) 按以下步骤制备空白样1:将0.1mL含阴离子表面活性剂的无菌水(8.4.8)、0.35mL生理盐
水和0.05mLATP消除剂加入塑料试管。摇匀并静置10min~20min;
f) 按以下步骤制备空白样2:取0.1mL空白样1转移到试管中,加入0.4mL生理盐水并摇匀;
g) 空白试验的准备:将0.1mL空白样2转移到2个塑料试管中以备空白试验用;
h) 将0.1mLATP萃取剂分别加入g)制备的2个盛有空白样2的塑料试管中并摇匀;
i) 加入0.1mLATP荧光剂并用试管振荡器搅拌5s;
j) 空白样2的荧光强度:立即用光度计(7.23)测定两个空白样的荧光强度;
k) 按照样液从最低浓度到最高浓度的顺序,将0.1mLATP萃取剂加入到二次稀释ATP样d)
中并摇匀;
l) 加入0.1mLATP荧光剂并用试管振荡器搅拌5s;
m)二次稀释ATP样的荧光强度:立即用光度计(7.23)测定两个二次稀释ATP样的荧光强度;
n) 按式(1)计算系数A 和B,以此建立校准曲线:
---系数A 可由 m)中所测得的二次稀释ATP试剂荧光强度的均值除以相应的ATP浓度
(mol/L)所得3个数值的平均值获得;
---系数B 通过式(1)在Y=0时,代入系数A 并将空白样2荧光强度的均值代入X 计算
获得。
Y=AX+B (1)
式中:
Y ---ATP浓度,单位为摩尔每升(mol/L);
X---荧光强度(RLU为相对光单位)。
当平均荧光强度和ATP浓度的相关系数低于0.99时,应重新制作ATP校准曲线。
12 试验方法
12.1 试样准备与接种
12.1.1 通用
可用吸收法和转移法进行接种。转移法适用于不吸水的纺织品。
12.1.2 吸收法
12.1.2.1 样品洗涤
必要时,按GB/T 20944.2-2007的10.1方法洗涤试样,洗涤后,用水漂洗试样以去除洗涤剂。若
使用其他未提及的方法应在报告中说明。
12.1.2.2 试样形状和质量
从样品上裁取代表性试样,并裁剪为合适尺寸,称取0.20g±0.03g作为1个试样。分别取6个对
照样和6个试样。
注:其中3个对照样和3个试样用于接种结束时的“0”接触时间测定荧光强度。剩余样品用于接种培养结束后的
接触时间测定荧光强度。
12.1.2.3 试样放置
根据试样的特性选取下列方法之一将各试样分别放入不同的螺口玻璃瓶(7.9):
a) 如果试样是易卷曲的纺织品,或具有絮片、羽绒,在螺口玻璃瓶(7.9)的试样上放置一根玻璃
棒,或用线将其两边固定;
b) 如果为纱线试样,将纱线捋成一束,并在螺口玻璃瓶(7.9)的试样上放置一根玻璃棒;
c) 如果为地毯或具有类似结构的样品,剪取样品上的起绒部分作为试样,并在螺口玻璃瓶(7.9)
的试样上放置一根玻璃棒。
12.1.2.4 试样灭菌
必要时,如对于被污染的试样,按以下步骤用高压灭菌锅(7.4)进行灭菌:
a) 用铝箔包覆装有试样的螺口玻璃瓶(7.9)顶部;
b) 将覆有铝箔的螺口玻璃瓶(7.9)放入金属篮中以备高压灭菌用;
c) 用铝箔包覆瓶盖并放入金属篮中;
d))将瓶盖和装有试样的螺口玻璃瓶(7.9)放入高压灭菌锅(7.4),于121℃(103kPa)灭菌
15min~20min;
e) 灭菌后,在无菌实验室内取掉铝箔,将装有试样的螺口玻璃瓶(7.9)放入二级生物安全柜(7.5)
或其他无空气污染风险的地方干燥至少60min;
f) 盖紧瓶盖。
注1:如果使用高压灭菌锅(7.4)或其他灭菌方法,在报告中说明,如使用环氧乙烷气体或γ射线。
注2:某些灭菌方法能使某些抗菌剂失活或增加释放从而得出错误结果。
注3:对照样用灭菌方法可与试样保持一致。
12.1.2.5 接种
分别准确移取0.2mL10.7中制备的1×105CFU/mL~3×105CFU/mL的孢子悬液,分散接种在
12.1.2.2制备的每个试样上。
注1:孢子悬液移取至试样上之前,使其混匀。
确保孢子悬液均匀分布在试样上的不同部位,用玻璃棒按压使孢子悬液被充分吸收。接种完成后
立即按第13章规定测定试样的荧光强度。
注2:对于不易吸收孢子悬液的试样,选用转移法。
12.1.3 转移法
12.1.3.1 试样准备
用裁样器裁剪直径约为3.8cm的对照样和试样各6块。试样上应无任何接缝、布边、绣花、紧固件
等。样品宜足够大(至少0.5m2)以满足重复性试验的需求。试样宜取自同一批且避开布边或起梗
部位。
分别称量并记录每个试样和对照样的质量(mA)。
必要时按GB/T 20944.2-2007的10.1方法洗涤试样,洗涤后,用水漂洗试样以去除洗涤剂。若使
用其他方法应在报告中说明。
必要时可使用高压灭菌锅(7.4)、环氧乙烷气体、γ射线或其他方法对试样进行灭菌。若使用其他
方法应在报告中说明。
12.1.3.2 接种到琼脂平皿
制备12个SDA琼脂平皿,培养皿(7.2)直径为55mm~60mm。将1mL初始孢子悬液接种到琼
脂上,沿不同方向倾斜平皿使其布满整个平皿表面。尽可能吸收多余液体,静置300s±30s。
12.1.3.3 转移到试样
制备6个对照样和6个试样,其中3个用于转移后立即使用,3个用于接种培养后。将每个试样放
置在琼脂表面并用200g不锈钢圆柱体压60s±5s。取下不锈钢圆柱体和试样并将每个试样分别放入
直径为55mm~60mm的培养皿(7.2)中,接触面朝上。
称量并记录培养皿(7.2)的质量(mB)及培养后试样和培养皿的总质量(mC)。
按下式计算试样中液体的质量(mD):
mD=mC-(mA+mB)
12.2 培养
12.2.1 吸收法
按12.1.2.5中规定将孢子悬液接种到试样上,在25℃±2℃条件中培养42h±2h。
12.2.2 转移法
按12.1.3.3转移后,在25℃±2℃的湿度箱中培养42h±2h。
13 荧光强度的测定
13.1 吸收法
荧光强度测定的准备过程如下(见图3):
f) 将0.1mL荧光剂加入到e)样液中,在振荡器中振荡5s,使用光度计测定荧光强度;
g) 测定两个试样的荧光强度。
14 计算
14.1 试验有效性的判定
当增长值符合b)中要求时,试验判为有效,否则试验无效,应重新进行试验:
a) 根据式(2)计算对照样的增长值F;
b......
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