SN/T 5227.2-2019 相关标准英文版PDF

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SN/T 5227.2-2019	英文版	209	SN/T 5227.2-2019	[PDF]天数 <=3	出口食品中猪源性成分快速检测重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA法)	SN/T 5227.2-2019	有效

基本信息
标准编号	SN/T 5227.2-2019 (SN/T5227.2-2019)
中文名称	出口食品中猪源性成分快速检测重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA法)
英文名称	(Rapid detection of pig-derived components in exported foods Recombinase-mediated strand replacement nucleic acid amplification method (RAA method))
行业	商检行业标准 (推荐)
中标分类	C53
国际标准分类	67.050
字数估计	9,948
发布日期	2019
实施日期	2020-07-01
发布机构	海关总署

SN/T 5227.2-2019 Rapid detection of porcine derived ingredient in food for export Recombinase-aid amplification （RAA） method 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 2019-12-27 发布 2020-07-01 实施中华人民共和国海关总署发布前言 SN/T 5227-2019《出口食品中动物源性成分快速检测重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）》分为 11 个部分：第 1 部分：出口食品中鸡源性成分快速检测重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；第 2 部分：出口食品中猪源性成分快速检测重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；第 3 部分：出口食品中羊源性成分快速检测重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；第 4 部分：出口食品中鸭源性成分快速检测重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；第 5 部分：出口食品中牛源性成分快速检测重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；第 6 部分：出口食品中水牛源性成分快速检测重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；第 7 部分：出口食品中马源性成分快速检测重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；第 8 部分：出口食品中驴源性成分快速检测重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；第 9 部分：出口食品中狐狸源性成分快速检测重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；第 10 部分：出口食品中貂源性成分快速检测重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；第 11 部分：出口食品中大鼠源性成分快速检测重组酶介导扩增链替换核酸法（RAA 法）。本部分为 SN/T 5227-2019 的第 2 部分。本标准按照 GB/T 1.1-2009 的规则进行编写。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国郑州海关、中华人民共和国石家庄海关、中国检验检疫科学研究院、浙江省食品药品检验研究院、中华人民共和国厦门海关、中华人民共和国大连海关、中华人民共和国北京海关、中华人民共和国拱北海关、中华人民共和国杭州海关、中华人民共和国成都海关。本标准主要起草人：苗丽、王建昌、王向军、韩建勋、沈泓、徐淑菲、郑秋月、汪琳、罗宝正、吴姗、林华、孔繁德。出口食品中猪源性成分快速检测重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法） 1 范围本部分规定了出口食品中猪源性成分的 RAA 检测方法。本部分适用于出口食品中猪源性成分的定性检测。此标准所规定方法的最低检出限（LOD）为 0.01 %（W/W）。 2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403-2008 实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3 术语、定义和缩略语 3.1　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 猪 Sus 偶蹄目，猪形亚目，猪科，猪属，分为家猪和野猪，亚种包括：欧洲中部野猪、东南亚野猪和印度野猪，一般认为这三个亚种构成了家猪的培育。 3.1.2 实时荧光 RAA real-time RAA 一种重组酶介导链替换的恒温核酸快速扩增技术（简称 RAA 技术）。利用从细菌或真菌中获得的重组酶，在恒温下（一般为 37 ℃~42 ℃），该重组酶可与引物紧密结合，形成酶和引物的聚合体，在单链 DNA 结合蛋白的帮助下，打开模板 DNA 的双链结构，当引物在模板 DNA 上搜索到与之完全匹配的互补序列时，在 DNA 聚合酶的作用下，形成新的 DNA 互补链，扩增产物以指数级增长。利用荧光探针的标记，随着 RAA 反应的进行，RAA 产物与荧光信号的增长呈现对应关系。 3.1.3 Ct 值 cycle threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。 3.1.4 T 值 Time threshold 每个反应管内荧光信号达到设定阈值时所需要的时间。 3.2　缩略语下列缩略语适用于本文件。 3.2.1　RAA ：recombinase-aid amplification，重组酶介导扩增。 3.2.2　DNA ：deoxyribonuleic acid，脱氧核糖核酸。 3.2.4　Tris ：tris（Hydroxymethyl）aminomethane，三羟甲基氨基甲烷。 3.2.5　EDTA ：ethylene diaminetetraacetic acid，乙二胺四乙酸。 3.2.6　dNTPs ：deoxyribonuleoside triphosphate，脱氧核苷三磷酸。 3.2.7　SSB ：single stranded DNA binding protein，单链 DNA 结合蛋白。 3.2.8　SC-recA ：Streptomyces coelicolor recombinase，天蓝色链霉菌重组酶。 3.2.9　BS-recA ：Bacillus subtilis recombinase，枯草芽孢杆菌重组酶。 3.2.10　Bsu ：Bacillus subtilis，枯草芽孢杆菌。 3.2.11 Tricine ：N-tris [Hydroxymethyl] methylglycine，N- 三羟甲基甲基氨基酸。 4 方法提要以提取的 DNA 为模板，采用猪的特异性检测引物和探针进行实时荧光 RAA 扩增，根据实时荧光 RAA 的增幅情况，实现对食品和饲料中猪成分的检测鉴定。 5 试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合 GB/T 6682 的要求。所有试剂均用无 DNA 酶污染的容器分装。 5.1 CTAB 提取缓冲液（pH8.0）：10 g/L CTAB，0.7 mol/L NaCl，0.05 mol/L Tris-HCl，0.01 mol/L Na2EDTA。 5.2 酚：氯仿：异戊醇 =25 ： 24 ： 1。 5.3 异丙醇。 5.4 70% 乙醇（V/V）。 5.5 TE 缓冲液（pH8.0）：10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1 mmol/L EDTA（pH8.0）。 5.6 A Buffer（缓冲液 A）：20% 聚乙二醇。 5.7 实时荧光 RAA 扩增体系：2.5 mmol/L dNTPs，225 ng/µL SSB，300 ng/µL recA 重组酶蛋白（SC- recA/BS-recA），75 ng/µL Bsu DNA 聚合酶，75 ng/µL Exo 核酸外切酶，250 mmol/L Tricine，12.5mmol/ L 二硫苏糖醇，250ng/µL 肌酸激酶。也可以使用等效的商品化的试剂盒代替。 5.8 B Buffer（缓冲液 B）：280mM 醋酸镁。 6 仪器设备 6.1 实时荧光 PCR 仪。 6.2 恒温荧光检测仪。 6.3 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 6.4 恒温水浴锅。 6.5 离心机：转速≥ 12 000 r/min。 6.6 微量移液器：量程 0.5 µL~10 µL，10 µL~100 µL，20 µL~200 µL，200 µL~1000 µL。 6.7 研钵及粉碎装置。 6.8 涡旋震荡器。 6.9 离心管：2 mL、1.5 mL。 7 检测步骤 7.1 DNA 提取取 0.2 g 粉碎或磨碎的样品至一洁净的 1.5 mL 离心管中（若样品含杂质和调味品，可加入 1 mLdd H2O 洗涤两次），加入 600 µL CTAB 提取缓冲液，涡旋震荡混匀后于 70 ℃温育 15 min，期间颠倒离心管 2 次 ~3 次； 12 000r/min 离心 5 min，取上清于一新的干净 1.5 mL 离心管中；加入 500 µL 酚：氯仿：异戊醇（25 ： 24 ： 1），上下颠倒离心管 2 次 ~3 次后涡旋震荡混匀，12 000 r/min 离心 5 min ；转移上层水相至一新的 1.5 mL 离心管中，加入 0.7 倍体积异丙醇，上下颠倒离心管 2~3 次，4 ℃静置 30 min，4 ℃下 12 000 r/min 离心 3 min，小心弃去上清液；加入 700 µL 70 % 乙醇，重悬沉淀，12 000 r/min 离心 1 min，小心弃去上清液；打开管盖，室温挥发干液体，加入 50 µL~100 µL TE（pH8.0）缓冲液溶解 DNA，-20 ℃保存备用。 DNA 提取也可采用等效 DNA 提取试剂盒进行。 7.2 DNA 浓度和纯度的测定使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测 260 nm 和 280 nm 处的吸光值 A260 和 A280。DNA 的浓度按照公式（1）计算： 7.3 实时荧光 RAA 扩增 7.3.1 实时荧光 RAA 反应总体系 7.3.2 实时荧光 RAA 反应程序可选用以下两种扩增仪器之一进行检测，反应程序对应如下。 7.3.2.1 实时荧光 PCR 仪 39℃，60s，1 个循环；39℃，30s，40 个循环，在每次循环时收集荧光。 7.3.2.2 恒温荧光检测仪 39℃，1min ；39℃，20min，第二阶段开始收集荧光。 7.3.3 实验对照检测过程中分别设阳性对照、阴性对照、空白对照。采用含有猪源成分的样品作为阳性对照样品，不含猪源成分的样品作为阴性对照，以与模板等体积的双蒸水作为空白对照。 8 质量控制 8.1 实时荧光 PCR 仪 8.1.1 空白对照：无荧光对数增长，相应的无报告 Ct 值。 8.1.2 阴性对照：无荧光对数增长，相应的无报告 Ct 值。 8.1.3 阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的 Ct 值≤ 30.0。 8.2 恒温荧光检测仪 8.2.1 空白对照：无荧光对数增长，相应的无报告 T 值（时间）。 8.2.2 阴性对照：无荧光对数增长，相应的无报告 T 值（时间）。 8.2.3 阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的 T 值（时间）≤ 15min。 9 结果判断与表述 9.1 结果判定 9.1.1 实时荧光 PCR 仪 9.1.1.1 在符合条款 8.1 的情况下，结果才能判为有效。 9.1.1.2 如 Ct 值≤ 35.0，则判定被检样品阳性。 9.1.1.3 如 35.0 ＜ Ct 值＜ 40.0，则重复一次。如再次检测结果仍然是 35.0 ＜ Ct 值＜ 40.0，则判定为被检样品阳性。 9.1.1.4 如无报告 Ct 值或无荧光对数增长则判定被检样品阴性。 9.1.2 恒温荧......

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