SN/T 5325.1-2020 相关标准英文版PDF

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SN/T 5325.1-2020	英文版	339	SN/T 5325.1-2020	[PDF]天数 <=4	出口食品中食源性病毒定量检测数字PCR法第1部分：诺如病毒	SN/T 5325.1-2020	有效

基本信息
标准编号	SN/T 5325.1-2020 (SN/T5325.1-2020)
中文名称	出口食品中食源性病毒定量检测数字PCR法第1部分：诺如病毒
英文名称	(Quantitative detection of food-borne viruses in exported food. Digital PCR method - Part 1: Norovirus)
行业	商检行业标准 (推荐)
中标分类	C53
国际标准分类	67.050
字数估计	16,167
发布日期	2020-12-30
实施日期	2021-07-01
标准依据	海关总署公告2020年第136号
发布机构	海关总署

SN/T 5325.1-2020: 出口食品中食源性病毒定量检测数字PCR法第1部分：诺如病毒 SN/T 5325.1-2020 英文名称: (Quantitative detection of food-borne viruses in exported food.Digital PCR method -- -- Part 1: Norovirus) 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出口食品中食源性病毒定量检测数字 PCR 法第 1 部分：诺如病毒中华人民共和国海关总署发布前言 SN/T 5235-2020《出口食品中食源性病毒定量检测数字 PCR 法》为系列标准，分为 7 个部分。第 1 部分：诺如病毒；第 2 部分：甲型肝炎病毒；第 3 部分：轮状病毒；第 4 部分：札如病毒；第 5 部分：星状病毒；第 6 部分：柯萨奇病毒；第 7 部分：脊髓灰质炎病毒。本部分为 SN/T 5235-2020 的第 1 部分。本部分根据 GB/T 1.1-2009 给出的规则编写。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由中华人民共和国海关总署提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国北京海关、中华人民共和国上海海关。本部分主要起草人：曾静、徐蕾蕊、魏海燕、马丹、印丽萍、黄新新、何宇平、蒋原。出口食品中食源性病毒定量检测数字 PCR 法第 1 部分：诺如病毒 1 范围本部分规定了贝类、硬质表面食品、生食蔬菜、软质水果等食品中诺如病毒的数字 PCR 检测方法。本部分适用于贝类、硬质表面食品、生食蔬菜、软质水果等食品中诺如病毒的定量检测。本方法所能达到的检测限为 1 800 拷贝/2 g（贝类消化腺）；1 800 拷贝/100 cm2（硬质表面食品）； 3 600 拷贝/25 g（生食蔬菜和软质水果）。本方法所能达到的定量限为 3 600 拷贝/2 g（贝类消化腺）；3 600 拷贝/100 cm2（硬质表面食品）； 7 200 拷贝/25 g（生食蔬菜和软质水果）。 2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析试验用水规格和试验方法。 3 术语、定义和缩略语下列术语和定义适用于本文件。 4 原理数字 PCR（digital PCR）是在荧光 PCR 基础上发展起来的基因拷贝数定量检测技术，用于核酸模板的绝对拷贝数测定。通过将含有模板、引物/探针、Taq 酶及其缓冲液的荧光 PCR 反应体系充分混匀之后等量均分为相互隔离的大数量（大于 10 000 个）微反应体系，使每个模板独立随机地分配至微反应体系中。所有微反应体系同时在相同的规定条件下进行 PCR 扩增反应后，根据设定的荧光阈值判断每个微反应体系的扩增结果。依据微反应体系的阳性率和泊松分布公式计算得到数字 PCR 反应体系中的模板浓度。 5 设备及材料 5.1 数字 PCR 系统：包括微反应体系发生器或其他具有同样功能的仪器、微反应体系荧光检测仪或其他具有同样功能仪器的系统。 5.2 核酸定量仪：Nanodrop3 000 或 Modulus 检测仪或其他核酸定量检测仪。 5.3 冷冻离心机。 5.4 生物安全柜。 5.5 低温冰箱：-80 ℃冰箱，-20 ℃冰箱。 5.6 天平：感量为 0.1 g。 5.7 均质器。 5.8 涡旋振荡仪。 5.9 高压灭菌锅。 5.10 恒温孵育器/箱：控温精度 ±1.0 ℃。 5.11 微量移液器：100 μL～1 000 μL、20 μL～200 μL、10 μL～100 μL、0.5 μL～10 μL、0.1 μL～2.5 μL。 5.12 数字 PCR 微反应体系生成联排管及覆膜或芯片。 5.13 网状过滤袋：400 mL。 5.14 无菌棉拭子。 5.15 无菌剪刀。 5.16 无菌钳子。 5.17 无菌培养皿。 5.18 无 RNase 和 DNase 污染的玻璃容器。 5.19 无 RNase 离心管、无 RNase 移液器吸嘴、无 RNase 药匙、无 RNase PCR 薄壁管。 6 试剂所有实验用试剂均为分析纯，符合 GB/T 6682 的要求；除特别说明外，实验用水为无 RNase 超纯水。 6.1 一步法数字 RT-PCR 反应预混液。 6.2 果胶酶：来源于黑曲霉（Aspergillus niger）或棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）。 6.3 PC 物质，制备及定量方法见附录 A。 6.4 EC RNA ：制备及定量方法见附录 B。 6.5 Tris/甘氨酸/牛肉浸膏（TGB E）缓冲液：见 C.2.2。 6.6 5×PEG/NaCl 溶液：见 C.2.3。 6.7 磷酸盐缓冲液（PBS）：见 C.2.4。 6.8 氯仿/正丁醇混合液：见 C.2.5。 6.9 蛋白酶 K 溶液：见 C.2.6。 6.10 75% 乙醇：见 C.2.7。 6.11 Trizol 试剂：见 C.2.8。 6.12 引物和探针：根据表 1 的序列合成引物和探针，加入无 RNase 超纯水配制成 10 μmol/L 浓度。扩增序列参见附录 D。 7 检测程序诺如病毒数字 PCR 定量检测程序见图 1。 8 操作步骤 8.1 质控物质的选取 8.1.1 PC 物质选择 MS2 噬菌体或其他等效物质作为 NV 检测的 PC 物质。体外培养获得准确的效价（浓度），达到 108 pfu/mL～1011 pfu/mL，分装后保存于 -80 ℃。使用时稀释至 107 pfu/mL～109 pfu/mL。 8.1.2 EC RNA 以含有 GⅠ型 NV 和 GⅡ型 NV 检测目的片段的 RNA 作为检测的 EC RNA，-80 ℃保存。也可购买含有 NV 检测目的片段 RNA 的有证标准物质。 8.2 不同食品基质中的病毒富集 8.2.1 软质水果 8.2.1.1 将 25 g 软质水果或生食蔬菜切成约 2.5 cm×2.5 cm×2.5 cm 的小块（如水果或蔬菜小于该体积，可不切）。 8.2.1.2 在软质水果或生食蔬菜表面添加 10 μL PC 物质，室温静置吸附 30 min。 8.2.1.3 将样品小块移至带有 400 mL 网状过滤袋的样品袋，加入 40 mL TGB E 溶液（软质水果样品，需加入 30 U A.niger 果胶酶或 1 140 U A.aculeatus 果胶酶）。 8.2.1.4 室温下 60 r/min，振荡 20 min。酸性软质水果需在振荡过程中，每隔 10 min 检测 pH，如 pH 值低于 9.0 时，使用 1 mol/L NaOH 调 pH 值至 9.5，每调整一次 pH 值，延长振荡时间 10 min。 8.2.1.5 将振荡液转移至 50 mL 离心管，4 ℃，10 000 r/min, 离心 30 min。上清液转移至干净离心管中，用 1 mol/L HCl 调 pH 至 7.0。 8.2.1.6 加入 0.25 倍体积 5×PEG/NaCl 溶液，摇匀，4 ℃过夜或 60 r/min 振荡 60 min。4 ℃，10 000 r/min，离心 10 min 紧实沉淀，弃上清液，加入 500 μL PBS 悬浮沉淀。 8.2.1.7 对于浆液过多的部分软果类样品，PBS 重悬后，加入 500 μL 的氯仿 -正丁醇，涡旋混合，室温下孵育 5 min，4 ℃，10 000 r/min，离心 15 min，取上清液用于提取 RNA。 8.2.2 硬质表面食品 8.2.2.1 向硬表面食品表面添加 10 μL PC 物质，添加面积不大于 100 cm2，室温静置吸附 30 min。 8.2.2.2 将无菌棉拭子使用 PBS 湿润后，用力擦拭食品表面（≤ 100 cm2）。记录擦拭面积。 8.2.2.3 将棉拭子浸入 490 μL PBS 缓冲液中，按压无菌棉，如此重复浸入和挤压 3 次～4 次，确保挤压出最大量的病毒，测定并记录液体 mL 数，用于后续 RNA 提取。 8.2.3 贝类 8.2.3.1 戴上防护手套，使用无菌贝类剥刀打开至少 10 个贝类。 8.2.3.2 使用无菌剪刀、手术钳或其他等效器具在胶垫上解剖出贝类软体组织中的消化腺，置于干净培养皿中。收集 2.0 g± 0.2 g 消化腺。 8.2.3.3 向收集的消化腺中添加 10 μL PC 物质，室温静置吸附 30 min。 8.2.3.4 使用无菌刀片或等效均质器将消化腺匀浆后，转移至离心管。加入 2.0 mL 蛋白酶 K 溶液，混匀。 8.2.3.5 使用恒温摇床或等效装置，37 ℃，320 次/min，振荡 60 min。 8.2.3.6 将离心管放入水浴或等效装置，60 ℃，15 min。室温，3 000 r/min，离心 5 min，取上清液，用于后续 RNA 提取。注：样品处理一般应在 4 ℃以下的环境中进行运输。实验室接到样品后应尽快进行检测，如果暂时不能检测应将样品保存在 -80 ℃冰箱中，试验前解冻。样品处理和 PCR 反应应在单独的工作区域或房间进行。每个样品可设置 2 个～ 3 个平行处理。 8.3 病毒 RNA 提取和纯化 8.3.1 病毒裂解将病毒提取液加入离心管，加入病毒提取液等体积 Trizol 试剂，混匀，激烈振荡，室温放置 5 min，加入 0.2 倍体积氯仿，涡旋剧烈混匀 30 s（不能过于强烈，以免产生乳化层，也可用手颠倒混匀），4 ℃，12 000 r/min，离心 5 min，上层水相移入新离心管中，不能吸出中间层。 8.3.2 病毒 RNA 提取离心管中加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温放置 5 min，4 ℃，12 000 r/min，离心 5 min，弃上清液，倒置于吸水纸上，沾干液体（不同样品须在吸水纸不同地方沾干）。 8.3.3 病毒 RNA 纯化 8.3.3.1 每次加入等体积 75% 乙醇，颠倒洗涤 RNA 沉淀 2 次。 8.3.3.2 于 4 ℃，12 000 r/min，离心 10 min，小心弃上清液，倒置于吸水纸上，沾干液体（不同样品须在吸水纸不同地方沾干），离心管内残留的上清液用微量加样器吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀，室温干燥 3 min，不能过于干燥，以免 RNA 不溶。 8.3.3.3 加入 100 μL 无 RNase 超纯水，轻轻混匀，溶解管壁上的 RNA，2 000 r/min，离心 5 s，冰上保存备用。注：病毒 RNA 可手工提取和纯化，也可使用商品化病毒 RNA 提取和纯化试剂盒。操作过程中应佩戴一次性橡胶或乳胶手套，并经常更换。提取出来的 RNA 立即进行反应，或保存在 4 ℃小于 8 h。如果长期储存建议 -80 ℃保存。 8.4 质量控制 8.4.1 空白对照，以无 RNase 超纯水作为空白对照。 8.4.2 阴性对照，以不含 NV 的食品样品，提取的 RNA，作为阴性对照。 8.4.3 阳性对照，以已知核酸浓度的 EC RNA，作为阳性对照。 8.4.4 PC 物质，以食品中 MS2 RNA 的回收率表示食品中 NV RNA 的回收率，用于评估检测过程的有效性和计算样品中 NV 的实际含量。 8.5 数字 PCR 扩增 8.5.1 RNA 模板稀释病毒 RNA 提取后，根据使用的数字 PCR 平台，选择适宜的稀释倍数进行 RNA 模板稀释，稀释液用于后续定量检测。 8.5.2 反应体系的设立每个样品的数字 PCR 反应设置 3 个平行，反应体系为：一步法数字 RT-PCR 反应预混液 10 μL， 10 μmol/L 上下游引物各 1.8 μL，10 μmol/L 探针 0.5 μL，RNA 模板 2 μL，补水至反应总体积为 20 μL。 8.5.3 微反应体系生成、数字 PCR 反应扩增及结果读取根据仪器要求，将配制好的数字 PCR 反应混合液，加入微反应体系生成装置的加样孔中，按仪器操作说明生成微反应体系。将微反应体系放置于 PCR 扩增仪中，按以下参数进行扩增：60 ℃， 30 min （1 ℃/s），1 个循环；95 ℃，5 min（1 ℃/s），1 个循环；94 ℃，30 s，55 ℃，1 min（1 ℃/s）， 40 个循环；98 ℃ 10 min（1 ℃/s），1 个循环；12 ℃保存反应产物。对微反应体系进行荧光检测。 9 结果分析与表述 9.1 阈值的设定根据数字 PCR 结果中阴......

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