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| 标准编号 | WS 295-2019 (WS295-2019) | | 中文名称 | 流行性脑脊髓膜炎诊断 | | 英文名称 | Diagnosis for meningococcal meningitis | | 行业 | 卫生行业标准 | | 中标分类 | C59 | | 国际标准分类 | 11.020 | | 字数估计 | 19,112 | | 发布日期 | 2019 | | 实施日期 | 2019-07-01 | | 发布机构 | 卫生健康委员会 | WS 295-2019
Diagnosis for meningococcal meningitis
ICS 11.020
C 59
WS
中 华 人 民 共 和 国 卫 生 行 业 标 准
代替 WS 295-2008
流行性脑脊髓膜炎诊断
2019 - 01 - 02发布
2019 - 07 - 01实施
中华人民共和国国家卫生健康委员会发布
II
前言
本标准的5.1、5.2、5.3为强制性条款，其余为推荐性条款。
本标准按照GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。
本标准代替WS 295-2008《流行性脑脊髓膜炎诊断标准》。
本标准与WS 295-2008相比，主要技术变化如下：
--增加了缩略语（见第 2章）；
--修改了流行病学史（见 3.1，2008 年版的 2.1）；
--修改了临床表现（见 3.2,2008年版的 2.2）；
--修改了“末梢血象”为“血常规”（见 3.3.1，2008年版的 2.3.1）；
--增加了脑脊液检查的结果（见 3.3.2）；
--增加了“瘀点（斑）组织液”（见 3.3.3.2和 3.3.3.3）；
--修改了诊断原则（见 4，2008年版的 3）；
--修改了“血清学”为“免疫学”（见 3.3.4，2008年版的 2.3.4）；
--修改了疑似病例（见 5.1，2008年版的 4.2）；
--修改了临床诊断病例（见 5.2，2008年版的 4.3）；
--修改了确诊病例（见 5.3，2008年版的 4.4）；
--增加了“其他脑膜炎球菌性疾病”（见 7.2）；
--增加了“鉴别诊断”（见附录 B的 B.4）；
--修改了脑膜炎奈瑟菌实验室检测方法（见附录 A）；
--根据流行性脑脊髓膜炎流行病学特征的变化，在附录 B 中，对流行性脑脊髓膜炎的病原
学、流行病学和临床表现中的有关描述予以订正（见附录 B）。
本标准起草单位：中国疾病预防控制中心、首都医科大学附属北京地坛医院、山东省疾病预防控制
中心、甘肃省疾病预防控制中心、山东大学齐鲁儿童医院、首都医科大学附属北京儿童医院、中国医
学科学院北京协和医院。
本标准主要起草人：李艺星、崔富强、邵祝军、李军宏、李兴旺、徐爱强、蒋荣猛、朱兵清、李慧、
盖中涛、申昆玲、吴丹、范洪伟。
本标准所替代标准的历次版本发布情况为：
--WS 295-2008。
流行性脑脊髓膜炎诊断
1 范围
本标准规定了流行性脑脊髓膜炎的诊断依据、诊断原则、诊断和鉴别诊断。
本标准适用于全国各级各类医疗卫生机构及其医务人员对流行性脑脊髓膜炎的诊断。
2 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
CFU/mL ：每毫升菌落形成单位（colony-forming unit/mL）
DIC：弥散性血管内凝血（disseminated or diffuse intravascular coagulation）
DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid）
ELISA：酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay）
IgG：免疫球蛋白G (immunoglobulin G)
OD：光密度（optical density）
PBS：磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline）
Real-time PCR ：实时荧光聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction)
SBA：血清杀菌力试验(serum bactericidal assays)
TTC：氯化三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride)
rpm：每分钟转数（revolutions per minute）
WHO：世界卫生组织(world health organization)
3 诊断依据
3.1 流行病学史
当地有本病发生或流行，或发病前10 d内有流行性脑脊髓膜炎流行地区居住或旅行史。
3.2 临床表现
3.2.1 潜伏期
数小时至 10 d，一般为 2 d～3 d。
3.2.2 主要临床症状和体征
3.2.2.1 发热、头痛、呕吐，和（或）有脑膜刺激征，婴幼儿可见前囟隆起。重症患者可有不同程度
的意识障碍和（或）感染中毒性休克。
3.2.2.2 皮肤、黏膜出现瘀点（斑）。瘀斑可迅速扩大融合成片。
3.3 实验室检测
3.3.1 血常规
白细胞总数、中性粒细胞计数明显升高。
3.3.2 脑脊液常规
典型改变为压力增高，外观呈浑浊米汤样或脓样；白细胞数明显增高，并以多形核白细胞增高为主；
糖及氯化物明显减少，蛋白含量升高。但在病程初期仅有压力升高，外观清亮，随后出现典型改变，暴
发休克型患者脑脊液通常清亮，蛋白、细胞数和糖亦无变化。
3.3.3 病原学
3.3.3.1 瘀点（斑）组织液、脑脊液涂片检测，可在多形核白细胞内或细胞外见到革兰阴性肾形双球菌。
3.3.3.2 脑脊液、血液、瘀点（斑）组织液培养脑膜炎奈瑟菌阳性。
3.3.3.3脑脊液、血液、瘀点（斑）组织液脑膜炎奈瑟菌特异性核酸检测阳性。
3.3.4 免疫学
3.3.4.1 急性期脑脊液样品脑膜炎奈瑟菌特异性多糖抗原检测阳性。
3.3.4.2 恢复期血清脑膜炎奈瑟菌特异性 IgG抗体检测，其效价较急性期呈 4倍或 4倍以上升高。
4 诊断原则
根据流行病学史和临床表现及血常规和(或)脑脊液常规检测结果做出疑似病例和（或）临床诊断病
例的诊断。
确诊需要脑膜炎奈瑟菌病原学或免疫学检测结果，对病原学检测阳性的病例进一步做出病原学分群
诊断（见附录 A的 A.3）。
5 诊断
5.1 疑似病例
同时符合3.1和3.2.2.1，并同时符合3.3.1、3.3.2任一项。
5.2 临床诊断病例
符合5.1并同时符合3.2.2.2。
5.3 确诊病例
符合5.1或5.2，并同时符合3.3.3、3.3.4中任一项。
5.4 临床分型
在临床诊断或确定诊断基础上，进行临床分型诊断（参见附录B的B.3）。
6 鉴别诊断
主要和其他细菌所致的脑膜炎、其他原因所致的脓毒症、各种原因引起的紫癜等疾病鉴别。婴幼儿
还应与高热惊厥等疾病鉴别（参见附录B的B.4）。
7 其他
7.1 带菌者
无临床症状和体征，咽拭子培养脑膜炎奈瑟菌阳性或脑膜炎奈瑟菌特异性核酸检测阳性。
7.2 其他脑膜炎球菌性疾病
人感染脑膜炎奈瑟菌后，大部分为无症状带菌者。出现症状者，临床疾病谱复杂多样，除可引起脑
脊髓膜炎外，还可引起脓毒症、肺炎，偶也可引发关节炎、心肌炎、心包炎和眼内炎等疾病。
附 录 A
（规范性附录）
脑膜炎奈瑟菌实验室检测方法
A.1 样品采集、处理和运送
A.1.1 样品采集和处理
A.1.1.1 脑脊液
无菌操作采集脑脊液至少2 mL，采集后立即送往微生物学实验室。如有条件，建议床旁接种，将适
量脑脊液（0.1 mL～0.5 mL）接种于5％羊血巧克力平板(以下简称巧克力平板)或血平板，三区划线后
送至实验室进行培养。
实验室收到脑脊液样品后，应在1 h内进行检测。首先将样品放入无菌试管，2 000 rpm～3 000
rpm，离心20 min，吸出上清液。上清液可用于脑膜炎奈瑟菌特异抗原检测，亦可将其置于-20℃，进
行其他检测。沉淀物部分应进行充分振荡混匀，用于培养及镜检。如脑脊液样品不足1 mL，则不进行
离心，直接进行平板接种培养和革兰染色镜检。
A.1.1.2 血液
如需开展核酸检测（如Real-time PCR检测），在离心之前无菌操作留取脑脊液样品200 µL，-20℃
以下保存。无菌采集患者急性期静脉血液5 mL～10 mL，立即送往微生物学实验室进行处理和检测。建
议床旁接种，将适量的血液（5 mL～10 mL）立即注入血培养瓶内，或将0.5 mL血液直接接种于巧克力
平板或血平板。剩余血液样品用于脑膜炎奈瑟菌特异性核酸检测或IgG抗体检测。采集患者发病急性期
和恢复期双份血液样品，分离血清，检测脑膜炎奈瑟菌特异性IgG抗体。采集血液样品过程中应不使用
抗凝剂。
建议在抗感染治疗之前，同时在不同部位各采集1份，共2份血液样品进行培养。新生儿采集1份血液样
品。
A.1.1.3 瘀点或瘀斑
选取患者皮肤上的新鲜瘀点或瘀斑，先用碘伏消毒，再用70％的酒精擦除碘伏，待酒精完全挥发后
用无菌针头挑破，挤出组织液，用消毒后的玻片直接蘸取组织液涂片，革兰染色镜检；随后用无菌棉签
蘸取组织液接种于巧克力平板或血平板，三区划线后送至实验室进行培养。
A.1.2 样品的运送
脑膜炎奈瑟菌对温度较为敏感，避免样品暴露于阳光、高温或寒冷的环境，温度过低或过高均可导
致病原菌死亡。在运送样品或培养物时，应保持样品处于25℃～35℃之间，不能低温运送（用于检测抗
体和核酸的样品除外）。
A.2 脑膜炎奈瑟菌培养及镜检
A.2.1 脑脊液样品培养
用灭菌的毛细管或微量移液器吸头吸取沉淀物直接接种于巧克力平板和（或）血平板，三区划线。
5％ CO2环境，37℃，培养24 h～72 h，每日检查细菌生长情况，及时对平板上的疑似菌落进行转种和
鉴定。
A.2.2 脑脊液样品镜检
吸取脑脊液样品离心后的沉淀物10 µL～20 µL，滴于载玻片上并涂开，在生物安全柜中风干玻片并
快速通过火焰3次以固定涂片，注意避免灼干。结晶紫染色1 min，用流动水冲洗玻片1 min，去除多余
水分；革兰碘液媒染1 min，用流动水冲洗玻片并干燥；95％乙醇脱色5 s～10 s；用番红染液复染20
s～30 s，或用酚红复染10 s～15 s，流动水冲洗玻片并晾干或蘸干。显微镜观察染色的涂片，在亮视
野的透镜和油镜下，脑膜炎奈瑟菌位于多形核白细胞内或细胞外，为革兰阴性、肾形双球菌。
A.2.3 血液样品分离培养
实验室接收到已接种血液样品的平板或血培养瓶后应立即置于37℃、5％ CO2的环境中，培养24 h～
72 h。如使用血培养瓶，每日观察细菌生长情况，如发现细菌生长，无菌操作取0.5 mL接种于巧克力平
板和（或）血平板。
A.2.4 脑膜炎奈瑟菌菌落形态
脑膜炎奈瑟菌可在血平板或巧克力平板上生长。在血平板上培养18 h～20 h后，可见圆形、光滑、
湿润、中央凸起、边界清晰、灰色的菌落，不溶血，菌落直径达1 mm。在巧克力平板上生长的菌落呈
现大菌落、无色或灰色、不透明。
A.2.5 脑膜炎奈瑟菌生化特征
采用氧化酶试验和糖代谢试验进行脑膜炎奈瑟菌的鉴定。如果氧化酶试验阳性，再进行糖代谢试
验。脑膜炎奈瑟菌能氧化葡萄糖和麦芽糖，但不氧化乳糖和蔗糖。
A.3 脑膜炎奈瑟菌血清学分群
A.3.1 试验方法
通过血清玻片凝集法可对脑膜炎奈瑟菌进行血清群鉴定，目前脑膜炎奈瑟菌已经确定了12个不同
的血清群，其中，A、B、C、W、X和Y是最常见的引起流行性脑脊髓膜炎的6种血清群。
A.3.2 实验操作
用乙醇擦净一块载玻片，用蜡笔或其它记号笔将载玻片分为多个部分，在每个部分的近底部处加
10 µL灭菌生理盐水，用无菌接种环或针、涂棒或牙签从巧克力平板或血平板上挑取适量细菌培养物，
在生理盐水中将培养物制成略呈乳液状的悬液用于测试。在每个部分的上部加上所选的血清10 µL或10
µL生理盐水或PBS。在亮光下或黑色背景下，将血清或生理盐水与各自的菌悬液混合，摇动玻片1
min～2 min（时间可能因血清生产商不同而有所差异）。
鉴于生物安全，WHO推荐使用福尔马林灭活的脑膜炎奈瑟菌悬液，而不是活菌的生理盐水悬液。福尔马林是一种致
癌物，在储存和使用时应高度小心，操作应在生物安全柜中进行。
A.3.3 实验结果的读取
血清可分群的脑膜炎奈瑟菌应只与一种分群血清凝集，与生理盐水或PBS不发生凝集。如果在生理
盐水或PBS中凝集，说明脑膜炎奈瑟菌有自凝性，判为自凝菌；如果无自凝现象，但与两种或两种以上
血清发生凝集，判为多凝菌；与任何一种血清或生理盐水或PBS都不能发生凝集，判为不凝菌；以上三
种情况均可报告为“血清不可分群脑膜炎奈瑟菌”。
A.4 流行性脑脊髓膜炎Real-time PCR诊断
A.4.1 种特异性 Real-time PCR检测
A.4.1.1 ctrA基因检测
绝大部分脑膜炎奈瑟菌含有ctrA基因（荚膜转运基因），少数菌株会缺失ctrA基因成不可分群菌
株。脑膜炎奈瑟菌侵袭性病例多由有荚膜的菌株感染引起，检测脑脊液、血液等无菌部位样品时，可
采用ctrA基因作为靶基因进行Real-time PCR检测。ctrA基因Real-time PCR引物和探针序列如下：
ctrA-Pb：5′-(FAM)AACCTTGAGCAA"T"CCATTTATCCTGACGTTCT (SpC6) -3′
“T”标记淬灭基团BHQ1。
A.4.1.2 sodC基因检测
脑膜炎奈瑟菌均含有sodC基因（铜-锌超氧化物歧化酶基因），其他种属细菌，如嗜血杆菌等也含
有sodC基因。如果考虑不可分群脑膜炎奈瑟菌也可偶然引起疾病，可检测sodC基因，其引物和探针序
列如下：
A.4.2 血清群特异性Real-time PCR检测
ctrA或sodC基因阳性的样品，可判断为脑膜炎奈瑟菌感染，需进行血清群特异性基因检测，以确定
脑膜炎奈瑟菌血清群。相应引物和探针序列见表A.1：
表 A.1 脑膜炎奈瑟菌血清群鉴定 Real-time PCR引物和探针序列
血清群 检测基因 引物/探针序列（5′-3 ′）
A sacB
B synD
Pb：FAM-AAGAGATGGGYAACAAC"T"ATGTAATGTCTTTATTT-SpC6
C synE
R：TGCTAATCCCGCCTGAATG
W synG
X xcbB
F：TGTCCCCAACCGTTTATTGG
Y synF
注：“T”标记淬灭基团BHQ1。
A.4.3 临床样品DNA处理
采用市售的DNA提取试剂盒，提取脑脊液、血液、瘀点（斑）组织液等临床样品中脑膜炎奈瑟菌的
DNA，不推荐采用直接煮沸方法。根据临床样品的类型、数量，以及其他革兰阳性菌感染的可能性，在
提取临床样品DNA前期处理时，建议加入溶菌酶和变溶菌素。
A.4.4 Real-time PCR反应体系和反应条件
PCR反应体系以20 µL为例，2×PCR反应混合物10 µL，上下游引物、探针各2 µL（ctrA上下游引物
和探针终浓度分别为0.9 µmol/L、0.9 µmol/L、0.1 µmol/L，sodC上下游引物和探针终浓度分别为0.3
µmol/L、0.6 µmol/L、0.1 µmol/L，分群引物和探针终浓度分别为0.6 µmol/L、0.6 µmol/L、0.1
µmol/L），根据荧光PCR仪的要求确定是否加入参比荧光 Rox 及加入量，DNA模板2 µL，超纯水补齐至
20 µL。反应条件：退火温度60℃，共50个循环；其他反应条件根据所使用的2×PCR反应混合物的说明
书进行调整。
A.4.5 Real-time PCR 检测结果的判断
扩增图应呈光滑的S型曲线，如果曲线的形状改变，应判断为阴性或者重新检测。手动拖拽阈值线
至基线上方后读取Ct值，根据以下标准判断检测结果。
“阳性”：Ct 值≤36；“阴性”：Ct 值≥40；“可疑”：Ct 值介于36～40
Ct 值介于36～40，结果为可疑，应重新检测。重新检测时可采取以下两种方法：
a) 将模板稀释 4～10倍和用 4 µL 模板代替 2 µL 两种方法重复检测。如果 Ct值≤36，该
样品判断为阳性，否则为阴性。
b) 同时设置三个平行孔检测，如果两个或三个孔出现良好的扩增曲线，判断为阳性，否则为
阴性。
A.5 采用PCR辅助鉴定疑似菌株
A.5.1 种特异性鉴定
crgA基因存在于所有脑膜炎奈瑟菌中，曾作为靶基因用于脑膜炎奈瑟菌种特异性鉴定。但由于部分
乳糖奈瑟菌也存在与脑膜炎奈瑟菌高度同源的crgA基因，建议结合crgA基因和sodC基因的检测结果进行
判定，两个基因检测结果同时阳性时可判定为脑膜炎奈瑟菌。crgA和sodC引物序列见表A.2：
表 A.2 脑膜炎奈瑟菌种属鉴定普通 PCR引物序列
检测基因 引物序列（5′-3′）
crgA
sodC
A.5.2 脑膜炎奈瑟菌分群鉴定
对明确鉴定为脑膜炎奈瑟菌的菌株可采用普通PCR方法进行分群鉴定，相应引物序列见表A.3：
表 A.3 常见脑膜炎奈瑟菌分群鉴定普通 PCR引物序列
血清群 检测基因 引物序列（5′-3′）
A orf-2
B siaD
C siaD
Y siaD
W siaD
X ctrA
F：GTCTTTGTATAAGGCCCAAG
R：TTGTCGCGGATTTGCAACTA
R：TTGTCGCGGATTTGCAACTA
可采用目前市售的DNA提取试剂盒提取......
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