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| 标准编号 | YY/T 0918-2014 (YY/T0918-2014) | | 中文名称 | 药液过滤膜、药液过滤器细菌截留试验方法 | | 英文名称 | Test method for determining bacterial retention of membrane/ filter assembly utilized for infusion liquid filtration | | 行业 | 医药行业标准 (推荐) | | 中标分类 | C31 | | 国际标准分类 | 11.040.20 | | 字数估计 | 15,132 | | 发布日期 | 6/17/2014 | | 实施日期 | 7/1/2015 | | 引用标准 | GB/T 6682; YY/T 0929.1 | | 标准依据 | 国家食品药品监督管理总局公告2014年第30号 | | 发布机构 | 国家食品药品监督管理总局 | | 范围 | 本标准适用于对标称孔径不超过0.22μm的医疗器械用除菌级药液过滤膜或药液过滤器的细菌截留能力进行评价。本标准规定了药液过滤膜、药液过滤器细菌截留试验方法。 | YY/T 0918-2014: 药液过滤膜、药液过滤器细菌截留试验方法
YY/T 0918-2014 英文版: Test method for determining bacterial retention of membrane/ filter assembly utilized for infusion liquid filtration
中华人民共和国医药行业标准
药液过滤膜、药液过滤器细菌截留试验方法
国家食品药品监督管理总局 发 布
1 范围
本标准规定的试验方法适用于对标称孔径不超过0.22μm的医疗器械用除菌级药液过滤膜或药液
过滤器的细菌截留能力进行评价。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
YY/T 0929.1 输液用除菌过滤器 第1部分:药液过滤器完整性试验
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
4 试验方法概述
用一定体积和浓度的缺陷假单胞菌(ATCC19146)菌悬液,以膜两侧不高于200kPa的压差和每平
方厘米有效过滤面积(EFA)2mL/min~4mL/min的流量,对灭菌后的供试过滤膜或过滤器进行挑
战,使最终挑战水平不低于107CFU/cm2EFA。全部的滤出液再经过分析滤膜过滤后,将分析滤膜置
于固体培养基上培养。能透过供试过滤膜或过滤器的细菌将会在分析滤膜上形成可见的菌落,并可进
行计数。
注:当需要考核过滤膜或过滤器长期使用是否能保持其细菌截留能力时,可采用附录A给出的试验方案。
5 意义和用途
5.1 本试验方法设计成在临床使用条件下评价除菌级过滤膜或过滤器的细菌截留能力。
5.2 每平方厘米有效过滤面积经受107 个细菌的挑战水平远远高于一般除菌过滤过程。选用该挑战
水平是为使过滤膜或过滤器能截留大量微生物提供高度的安全保证。
6 仪器
6.1 不锈钢压力容器。
6.2 空气调节器。
6.3 47mm过滤装置,以软管相连。
6.4 隔膜保护压力表,适宜量程。
6.5 阀门,耐高压蒸汽,以软管相连。
6.6 管路,耐高压蒸汽,能承受350kPa的压力。
6.7 液体流量计。
6.8 软管夹。
6.9 生化培养箱,30℃±2℃。
6.10 生物安全柜。
6.11 超净工作台。
仪器组装如图1所示。
7 试剂和材料的纯度
7.1 试剂的纯度
应用化学纯试剂。
7.2 水的纯度
除非另有说明,试验用水都应符合GB/T 6682中规定的二级水。本试验方法中的任何用水都应是
非抑菌水。
8 试剂和材料
8.1 盐水乳糖肉汤培养基
8.1.1 乳糖肉汤 将1.3g脱水乳糖肉汤培养基溶入100mL水中。
8.1.2 氯化钠溶液 将7.6g氯化钠溶入盛有970mL水的2L具塞烧瓶中。
8.1.3 将30mL乳糖肉汤(8.1.1)加入到970mL氯化钠溶液,121℃灭菌15min。
8.2 制备冷冻菌糊所用试剂
8.2.1 生长培养基A(pH6.8~7.0)
以下成分溶入水中并稀释到1L。121℃灭菌15min。
胰蛋白胨(或酪胨) 7.5g
酵母浸出物 2.5g
氯化钠(NaCl) 0.5g
硫酸镁(MgSO4·3H2O) 0.35g
8.2.2 保存用缓冲液
将0.790g的磷酸二氢钾(KH2PO4)和1.0g的磷酸氢二钾(K2HPO4)溶入100mL丙三醇。用氢
氧化钾溶液[c(KOH)=0.1mol/L]调pH到7.2,用水稀释到1L,121℃灭菌15min。
8.2.3 氢氧化钾[c(KOH)=0.1mol/L]
将5.61g的氢氧化钾(KOH)溶入水中,并在容量瓶中定容至1L。
8.2.4 胰蛋白大豆琼脂
按制造商说明制备。
8.2.5 胰蛋白大豆肉汤
按制造商说明制备。
8.3 分析试剂和材料
8.3.1 M平板计数琼脂
按制造商说明制备。
8.3.2 蛋白胨水(1g/L)
将蛋白胨溶入水中,以合适体积分装于螺口瓶中,以便于制备10倍稀释液,121℃灭菌15min。
8.4 缺陷假单胞菌
缺陷假单胞菌(ATCC19146)。
8.5 分析滤膜
直径47mm,孔径0.45μm。
9 细菌挑战原液制备方法
9.1 总则
以下两种方法已被广泛用于缺陷假单胞菌悬液的制备。这些方法并不排斥其他等同有效的方法。
然而,重要的是所应用的所有缺陷假单胞菌挑战悬液都是单分散的,同时应符合第10章的规定。
9.2 菌种分离和保藏
根据缺陷假单胞菌的说明进行培养,通过划线平板来检查纯度。检查菌落形态是否一致,按第10章
鉴定缺陷假单胞菌单菌落。
9.2.1 储用培养物
用9.2分离得到的单菌落来制备储用培养物。接种胰蛋白大豆琼脂斜面,在30℃±2℃条件下培
养24h。用无菌液状石腊覆盖斜面,4℃保存。每周检查一次活力和纯度。也可选用胰蛋白大豆半固
体琼脂穿刺培养来替代斜面培养。
9.2.2 培养物的长期保藏
冻干或液氮保存。
9.3 在盐水乳糖肉汤中制备挑战原液
9.3.1 向10mL无菌胰蛋白大豆肉汤接种储用培养物(9.2.1),30℃±2℃培养24h。
9.3.2 将2mL混匀的肉汤培养液移入1L无菌盐水乳糖肉汤中,涡旋混合,30℃±2℃培养24h。
注:盐水乳糖肉汤菌悬液临用前可以在4℃保存,但不超过8h。
9.3.3 按第11章测定挑战菌悬液中活菌的浓度(一般浓度为107CFU/mL~108CFU/mL)。
9.3.4 按第10章鉴定缺陷假单胞菌。
9.4 制备缺陷假单胞菌冷冻菌糊
9.4.1 向10mL无菌生长培养基A(8.2.1)接种储用培养物(9.2.1),30℃±2℃培养24h。
9.4.2 将10mL由9.4.1得到的细菌悬液移入500mL无菌生长培养基A中,30℃±2℃培养24h。
9.4.3 将200mL由9.4.2得到的细菌悬液移入10L无菌生长培养基A,制备10L种子培养液,30℃±
2℃培养24h。
9.4.4 将上述10L种子培养液接种到500L生长培养基A中。在30℃±2℃有氧培养。通过500nm下
分光光度分析对生长进行监视,绘制生长曲线。
9.4.5 当培养达到静止生长期时,通过连续离心收集菌体。
9.4.6 用2~3倍体积的冷的无菌保存用缓冲液重悬菌体。
9.4.7 离心菌体悬液,再用等体积的保存用缓冲液重悬菌体。测定菌体浓度(活菌浓度一般为
1×1012CFU/mL)。
9.4.8 将全部菌糊(如50mL)移入无菌塑料离心试管,用干冰丙酮或液氮冷冻,在-60℃条件下保存。
9.5 用冷冻菌糊制备挑战原液
9.5.1 用无菌钳夹持试管,将其浸渍于80%(体积分数)酒精中进行消毒,点燃酒精至多数酒精被烧光。
9.5.2 无菌取下试管帽,常温条件下,将试管投入盛有无菌磁力搅拌棒和20倍于菌糊体积的含
0.001mol/L~0.002mol/L氯化镁(MgCl2)的无菌生理盐水的锥形瓶中(例如,将50mL冷冻菌糊移
入1L无菌溶液中)。
注:加入冷冻菌糊前需先将氯化镁(MgCl2)溶解于溶剂中。
9.5.3 将烧瓶放置于磁力搅拌器上,混合直到试管内容物悬浮均匀(40min)。
9.5.4 按第11章测定活菌浓度(菌悬液浓度一般为1×1010CFU/mL~2×1010CFU/mL)。
9.5.5 按第10章鉴定缺陷假单胞菌。
10 缺陷假单胞菌的鉴定
10.1 菌落形态
10.1.1 缺陷假单胞菌的菌落呈米黄色,轻微突起,完整透明。
10.1.2 在30℃(最佳生长温度)培养24h后,生长至针尖般大小,培养36h~48h后直径为1mm~
2mm。
10.2 显微观察
10.2.1 进行革兰氏染色。
10.2.1.1 用装有经校准的目镜千分尺和良好分辨率油镜镜头的复合光学显微镜来检查所制备的菌株。
观察几个视场中微生物的大小和分布情况。
10.2.1.2 染色所制备的菌株,应为革兰氏阴性、尺寸为(0.3μm~0.4μm)×(0.6μm~1.0μm)的短小
杆状菌,主要以单细胞形式存在。
10.2.2 进行鞭毛染色(可选)。缺陷假单胞菌具有极生单鞭毛的特征。
10.3 生化特性
进行如下生化特性试验,缺陷假单胞菌具有以下生化特性:
11 细菌挑战悬液的制备
11.1 用直接显微镜计数测定菌悬液的浓度。这样可以测定出总细菌数量,包括活菌和非活菌。
11.2 应用合适体积的挑战原液,在盐水乳糖肉汤或无菌生理盐水中制备合适体积和浓度的缺陷假单
胞菌挑战悬液,使每平方厘米测试滤膜至少经受107 个微生物的挑战,充分混合。
11.3 在无菌条件下从所制备的缺陷假单胞菌挑战悬液中取样。
11.4 在无菌条件下用0.1%蛋白胨水稀释菌悬液到10-6稀释度。
11.5 采用薄膜过滤法或直接平板涂布法进行两个平行活菌分析。
11.5.1 对于薄膜过滤法,分别用1mL10-4~10-6稀释度的稀释液进行过滤。在加入1.0mL十倍稀
释液之前,先在过滤夹持器的漏斗中加入50mL无菌生理盐水,过滤后再用50mL无菌生理盐水冲洗
漏斗壁,从漏斗上取下分析滤膜,置于琼脂培养基上。
11.5.2 对于直接平板涂布法,分别用0.1mL10-3、10-4、10-5稀释度的稀释液直接涂板。
11.6 在30℃±2℃条件下培养薄膜过滤平板或直接涂布平板48h。
11.7 取30CFU~300CFU的直接涂布平板或20CFU~200CFU的薄膜过滤平板进行菌落计数,计
算初始菌悬液浓度(CFU/mL)。
11.8 将活菌浓度与11.1中直接显微镜计数结果进行比较。活菌数应不小于总菌数的25%。
12 样品和仪器准备
12.1 对滤膜材料进行试验时,将其裁切成ϕ47mm的圆形试验样品,装入过滤装置。对于已经过灭菌
的药液过滤器进行试验时,直接取成品试验,试验前无需进行灭菌。
12.2 将试验样品过滤组件(对于滤膜材料)、阴性对照过滤组件和阳性对照过滤组件分别用灭菌纸包
裹进口和出口接头,按制造商说明书进行灭菌。灭菌程序宜采用生物指示物或热电偶进行确认。
如需要,按YY/T 0929.1在无菌条件下对试验样品过滤组件进行完整性测试。
12.3 将试验分析滤膜过滤组件进口和出口处各连接一段可蒸汽灭菌的管路,用灭菌纸包裹软管末端,
按制造商说明书进行灭菌。灭菌程序宜采用生物指示物或热电偶进行确认。
12.4 用灭菌纸包裹试验样品过滤组件、阴性对照过滤组件和阳性对照过滤组件下游的其他管路和连
接件,按制造商说明书进行灭菌。灭菌程序宜采用生物指示物或热电偶进行确认。
12.5 在无菌条件下按图1对实验仪器进行组装。
12.6 压力容器和上游连接管路不需要蒸汽灭菌,但是宜在试验前彻底清洗,消毒,并用无菌水冲洗。
压力容器可用5%次氯酸钠溶液或70%乙醇消毒,晾干,并用水彻底清洗。
13 试验步骤
13.1 阴性对照
13.1.1 阴性对照在细菌挑战试验前进行,并且对照分析滤膜与试验分析滤膜和阳性对照分析滤膜同
时培养。
13.1.2 在压力容器中加入至少500mL盐水乳糖肉汤或无菌生理盐水。
13.1.3 关闭阀门A和B和可调阀门A、B、C和D,打开阀门C。
13.1.4 对压力容器加压到200kPa。
13.1.5 缓慢打开可调阀门D,让液体充满阴性对照过滤组件和其下游的分析过滤组件。将各过滤装置
中空气排入合适消毒剂中。当各过滤组件中充满液体时,关闭其排气阀。
13.1.6 打开可调阀门D,并用可调阀门C调节流量为每平方厘米阴性对照过滤膜有效过滤面积
2mL/min~4mL/min。
13.1.7 当全部液体过滤完成后,关闭阀门C和可调阀门C。
13.1.8 关闭空气调节器并释放容器内压力。
13.1.9 取下该分析过滤组件,从下游抽真空15s,除去所有液体,在无菌条件下将膜从过滤组件转移
至 M平板计数琼脂上,30℃±2℃培养,在第72小时和第7天记录菌落数。
13.2 细菌挑战试验和阳性对照试验
13.2.1 在压力容器中加入第11章制备的所需体积(每支路至少500mL)的菌悬液。
13.2.2 关闭阀门C和可调阀门A、B、C和D,打开阀门A和B。
13.2.3 对压力容器加压到200kPa。
13.2.4 缓慢打开可调阀门D,让挑战菌悬液充满试验样品过滤组件、阳性对照过滤组件和它们下游的
分析过滤组件。将各过滤组件中空气排入合适消毒剂中。当各过滤组件中充满液体时,关闭其排气阀。
13.2.5 打开可调阀门A和B。
13.2.6 打开可调阀门D,并用可调阀门A和B调节流量为每平方厘米供试过滤膜和阳性对照过滤膜
有效过滤面积2mL/min~4mL/min。
13.2.7 当全部液体过滤完成以后,关闭阀门A、B和可调阀门A、B。
13.2.8 关闭空气调节器并释放容器内压力。
13.2.9 取下各支路分析过滤组件,从下游抽真空15s,除去所有......
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