[PDF] GB 4789.34-2012 - 中国标准 英文版
| 标准号码 | 美元 | 购买PDF | 工期 | 标准名称(英文版) |
| GB 4789.34-2012 | 519 | GB 4789.34-2012 | <=3 | 食品安全国家标准 食品微生物学检验 双歧杆菌的鉴定 |
| 基本信息 | |
|---|---|
| 标准编号 | GB 4789.34-2012 (GB4789.34-2012) |
| 中文名称 | 食品安全国家标准 食品微生物学检验 双歧杆菌的鉴定 |
| 英文名称 | National food safety standards -- Microbiological examination of food -- Identification of bifidobacteria |
| 行业 | 国家标准 |
| 中标分类 | C53 |
| 国际标准分类 | 07.100.30 |
| 字数估计 | 13,193 |
| 旧标准 (被替代) | GB/T 4789.34-2008 |
| 标准依据 | 卫生部公告2012年第9号 |
| 发布机构 | 中华人民共和国卫生部 |
| 范围 | 本标准规定了食品中双歧杆菌(Bifidobacterium)的鉴定方法。本标准适用于食品中双歧杆菌的鉴定。 |
GB 4789.34-2012
中华人民共和国国家标准
食品安全国家标准
食品微生物学检验 双歧杆菌的鉴定
中华人民共和国卫生部 发布
2012-05-17 发布
2012-07-17 实施
前言
本标准代替 GB/T 4789.34-2008 《食品卫生微生物学检验 双歧杆菌检验》。
本标准与 GB/T 4789.34-2008 相比，主要变化如下：
--修改了标准的中文名称；
--修改了培养基和试剂；
--删除了果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶（F6PPK）测定和双歧杆菌的计数方法。
食品安全国家标准
食品微生物学检验 双歧杆菌的鉴定
1 范围
本标准规定了食品中双歧杆菌（Bifidobacterium ）的鉴定方法。
本标准适用于食品中双歧杆菌的鉴定。
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
a） 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃；
b） 气相色谱仪配 FID 检测器；
c） 冰箱：2 ℃～5 ℃；
d） 天平： 感量 0.1 g；
e） 无菌试管：18 mm×180 mm、15 mm×100 mm；
f） 无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器（200 μL～1000 μL）
及配套吸头；
g） 无菌锥形瓶：500 mL、250 mL。
3 培养基和试剂
3.1 双歧杆菌培养基：见附录 A 中的 A.1。
3.2 PYG 液体培养基：见附录 A 中的 A.2。
3.3 甲醇：分析纯。
3.4 三氯甲烷：分析纯。
3.5 硫酸：分析纯（体积比）。
3.6 冰乙酸：分析纯（体积比）。
3.7 乳酸：分析纯。
3.8 乙酸标准溶液：吸取分析纯冰乙酸5.7 mL，移入100 mL容量瓶中，加水至刻度，标定，标定方法见附
录B，此溶液浓度约为1 mol/L。
3.9 乙酸标准使用液：将经标定的乙酸标准溶液用水稀释至0.01 mol/L。
3.10 乳酸标准溶液：吸取分析纯乳酸8.4 mL，移入100 mL容量瓶中，加水至刻度，标定，标定方法见附
录B，此溶液浓度约为1 mol/L。
3.11 乳酸标准使用液：将经标定的乳酸标准溶液用水稀释至0.01 mol/L。
4 鉴定程序
双歧杆菌鉴定程序见图 1。
图1 双歧杆菌鉴定程序
5 操作步骤
5.1 样品制备
5.1.1 样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。
5.1.2 以无菌操作称取 25 g（mL）样品，置于装有 225 mL 生理盐水的灭菌锥形瓶内，制成 1:10 的样品匀
液。
5.2 稀释及涂布培养步骤
厌氧，48 h
36 ℃±1 ℃
样品 25 g（mL）+225 mL 灭菌生理盐水
10 倍系列稀释
革兰氏染色，过氧化氢酶试验
报告
选择 2 个～3 个适当稀释度，各取 0.1 mL
分别加入到双歧杆菌琼脂平板进行涂布
挑取菌落接种于双歧杆菌琼脂平板
接种 PYG 液体培养基 生化反应
测定乙酸、乳酸
厌氧，48 h
36 ℃±1 ℃
厌氧，48 h
36 ℃±1 ℃
5.2.1 用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1.0 mL，沿管壁缓慢注于装有 9 mL 生理盐水的
无菌试管中（注意吸管尖端不要触及稀释液），振摇试管或换用 1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制
成 1:100 的样品匀液。
5.2.2 另取 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸头，按 5.2.1 操作顺序，做 10 倍递增样品匀液，每递增稀释一
次，即换用 1 次 1 mL 灭菌吸管或吸头。
5.2.3 根据待鉴定菌种的活菌数，选择三个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取 0.1 mL 稀释液，用 L 棒
在双歧杆菌琼脂平板进行表面涂布, 每个稀释度作两个平皿。置 36 ℃±1 ℃ 温箱内培养 48 h±2 h，培养后
选取单个菌落进行纯培养。
5.3 纯培养
挑取 3 个或以上的菌落接种于双歧杆菌琼脂平板，厌氧，36 ℃±1 ℃ 培养 48 h。
5.4 镜检及生化鉴定
5.4.1 涂片镜检
双歧杆菌菌体为革兰氏染色阳性，不抗酸、无芽孢，无动力，菌体形态多样，呈短杆状、纤细杆状或
球形，可形成各种分支或分叉形态。
5.4.2 生化鉴定
过氧化氢酶试验为阴性。选取纯培养平板上的三个单个菌落，分别进行生化反应检测，不同双歧杆菌
菌种主要生化反应见附录B。
5.5 有机酸代谢产物测定
气相色谱法测定双歧杆菌的有机酸代谢产物, 见附录 C。
6 报告
根据镜检及生化鉴定的结果（5.4）、双歧杆菌的有机酸代谢产物乙酸与乳酸微摩尔之比大于 1（5.5），
报告双歧杆菌属的种名。
附录 A
培养基
A.1 双歧杆菌琼脂培养基
A.1.1 成分
蛋白胨 15.0 g
酵母浸膏 2.0 g
葡萄糖 20.0 g
可溶性淀粉 0.5 g
氯化钠 5.0 g
西红柿浸出液 400.0 mL
吐温 80 1.0 mL
肝粉 0.3 g
琼脂粉 15.0 g～20.0 g
加蒸馏水至 1 000.0 mL
A.1.2 制法
A.1.2.1 半胱氨酸盐溶液
称取半胱氨酸 0.5 g，加入 1.0 mL 盐酸，使半胱氨酸全部溶解，配制成半胱氨酸盐溶液。
A.1.2.2 西红柿浸出液
将新鲜的西红柿洗净后称重切碎，加等量的蒸馏水在 100 ℃水浴中加热，搅拌 90 min，然后用纱布
过滤，校正 pH7.0，将浸出液分装后，121 ℃高压灭菌 15 min～20 min。
A.1.2.3 培养基
将 A.1.1 所有成分加入蒸馏水中，加热溶解, 然后加入半胱氨酸盐溶液，校正 pH 6.8±0.2。分装后 121
℃高压灭菌 15 min～20 min。临用时加热熔化琼脂，冷至 50 ℃时使用。
A.2 PYG 液体培养基
A.2.1 成分
蛋白胨 10.0 g
葡萄糖 2.5 g
酵母粉 5.0 g
半胱氨酸-HCl 0.25 g
盐溶液 20.0 mL
维生素 K1溶液 0.5 mL
氯化血红素溶液 5mg/mL 2.5 mL
加蒸馏水至 500.0 mL
A.2.2 制法
A.2.2.1 盐溶液
称取无水氯化钙 0.2 g，硫酸镁 0.2 g，磷酸氢二钾 1.0 g，磷酸二氢钾 1.0 g，碳酸氢钠 10.0 g，氯化
钠 2.0 g，加蒸馏水至 1000 mL。
A.2.2.2 氯化血红素溶液（5mg/mL）
称取氯化血红素 0.5 g 溶于 1 mol/L 氢氧化钠 1.0 mL 中，加蒸馏水至 1000 mL，121 ℃高压灭菌 15
min～20 min。
A.2.2.3 维生素 K1溶液
称取维生素 K11.0 g，加无水乙醇 99 mL，过滤除菌，冷藏保存。
A.2.2.4 培养基
除氯化血红素溶液和维生素 K1溶液外，A.2.1 其余成分加入蒸馏水中，加热溶解，校正 pH6.0，加
入中性红溶液。分装后 121 ℃高压灭菌 15 min～20 min。临用时加热熔化琼脂，加入氯化血红素溶液和
维生素 K1 溶液，冷至 50 ℃使用。
附录 B
双歧杆菌菌种主要生化反应
双歧杆菌菌种主要生化反应见表 B.1。
表 B.1 双歧杆菌菌种主要生化反应
编号 项目
两歧双歧杆菌
(B.bifidum)
婴儿双歧杆菌
(B.infantis)
长双歧杆菌
(B.longum)
青春双歧杆菌
(B.adolescentis)
动物双歧杆菌
(B.animalis)
短双歧杆菌
(B.breve)
1 甘油 - - - - - -
2 赤癣醇 - - - - - -
3 D-阿拉伯糖 - - - - - -
4 L-阿拉伯糖 - - + + + -
5 D-核糖 - + - + + +
6 D-木糖 - + + d + +
7 L-木糖 - - - - - -
8 阿东醇 - - - - - -
9 β-甲基-D-木糖甙 - - - - - -
10 D-半乳糖 d + + + d +
11 D-葡萄糖 + + + + + +
12 D-果糖 d + + d d +
13 D-甘露糖 - + + - - -
14 L-山梨糖 - - - - - -
15 L-鼠李糖 - - - - - -
16 卫矛醇 - - - - - -
17 肌醇 - - - - - +
18 甘露醇 - - - - - -
19 山梨醇 - - - - - -
20 α-甲基-D-甘露糖甙 - - - - - -
21 α-甲基-D-葡萄糖甙 - - + - - -
22 N-乙酰-葡萄糖胺 - - - - - +
23 苦杏仁甙（扁桃甙） - - - + + -
24 熊果甙 - - - - - -
25 七叶灵 - - + + + -
26 水杨甙（柳醇） - + - + + -
27 D-纤维二糖 - + - d - -
28 D-麦芽糖 - + + + + +
29 D-乳糖 + + + + + +
30 D-蜜二糖 - + + + + +
31 D-蔗糖 - + + + + +
32 D-海藻糖（覃糖） - - - - - -
33 菊糖（菊根粉） - - - - - -
34 D-松三糖 - - + + - -
35 D-棉籽糖 - + + + + +
表 B.1（续） 双歧杆菌菌种主要生化反应
项目
两歧双歧杆菌
(B.bifidum)
婴儿双歧杆菌
(B.infantis)
长双歧杆菌
(B.longum)
青春双歧杆菌
(B.adolescentis)
动物双歧杆菌
(B.animalis)
短双歧杆菌
(B.breve)
36 淀粉 - - - + - -
37 肝糖（糖原） - - - - - -
38 木糖醇 - - - - - -
39 龙胆二糖 - + - + + +
40 D-松二糖 - - - - - -
41 D-来苏糖 - - - - - -
42 D-塔格糖 - - - - - -
43 D-岩 糖 - - - - - -
44 L-岩 糖 - - - - - -
45 D-阿糖醇 - - - - - -
46 L-阿糖醇 - - - - - -
47 葡萄糖酸钠 - - - + - -
48 2-酮基-葡萄糖酸钠 - - - - - -
49 5-酮基-葡萄糖酸钠 - - - - - -
注：+表示 90％以上菌株阳性；-表示 90％以上菌株阴性；d表示 11％～89％以上菌株阳性。
附录 C
气相色谱法测定双歧杆菌的有机酸代谢产物
C.1 双歧杆菌培养液制备
挑取双歧杆菌琼脂平板上纯培养的双歧杆菌接种于PYG液体培养基，同时用未接种菌的PYG液体培
养基做空白对照，厌氧，36 ℃±1 ℃ 培养48 h。
C.2 标准液的配制
C.2.1 乙酸标准溶液
准确吸取乙酸 5.70 mL 加水稀释至 100.0 mL，摇匀，进行标定，配成约 1.0 mol/L 的乙酸标准溶液。
标定方法为：准确称取乙酸 3 g，加水 15 mL，酚酞指示液 2 滴，用 1 mol/mL 氢氧化钠溶液滴定，并将
滴定结果用空白试验校正。1 mL 1 mol/mL 氢氧化钠溶液相当于 60.05 mg 的乙酸。
C.2.2 乙酸使用液
将经标定的乙酸标准溶液用水稀释至 20.0 mmol/L。
C.2.3 乳酸标准溶液
准确吸取含量为85%～90%的乳酸0.84 mL，加水稀释至100.0 mL，摇匀，配成1.0 mol/L的乳酸标准
溶液。标定方法为：准确称取乳酸1 g，加水50 mL，加入1 mol/mL氢氧化钠滴定液25 mL，煮沸5 min，
加入酚酞指示液2滴，同时用0.5 mol/mL硫酸滴定液滴定，并将滴定结果用空白试验校正。1 mL 1 mol/mL
氢氧化钠溶液相当于90.08 mg的乳酸。
C.2.4 乳酸使用液
将乳酸标准溶液用水稀释至 20.0 mmol/L。
C.3 方法
C.3.1 乙酸的处理
取双歧杆菌培养液 2.0 mL～3.0 mL 放入 10 mL 离心管中，加入 0.2 mL 50％（体积比）硫酸溶液，
混匀，加入 2.0 mL 丙酮，混匀后加过量氯化钠，剧烈振摇 1 min，再加入 2.0 mL 乙醚，振摇 1 min 后，
于 3000 r/min 离心 5 min，将上清液转入另一试管中，下层溶液用 2.0 mL 丙酮和 2.0 mL 乙醚重复提取 2
次，合并有机相，于 40 ℃水浴中用氮气吹至少量溶液存在，用丙酮定容至 1.0 mL，混匀后备用。同样
操作步骤处理乙酸标准和空白培养液。
C.3.2 乳酸的处理
取双歧杆菌培养液 2.0 mL～3.0 mL 放入 10 mL 比色管中，100 ℃水浴 10 min，加入 0.2 mL 50%（体
积比）硫酸溶液，混匀，加入 1.0 mL 甲醇，于 58 ℃水浴 30 min 后加水 1.0 mL，加......