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[PDF] GB 4789.35-2016 - 中国标准 英文版

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GB 4789.35-2016 85 GB 4789.35-2016 9秒内发货PDF 食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验
基本信息
标准编号 GB 4789.35-2016 (GB4789.35-2016)
中文名称 食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验
英文名称 National food safety standard -- Microbiological examination of food -- Examination of lactic acid bacteria
行业 国家标准
中标分类 C53
字数估计 10,129
发布日期 2016-12-23
实施日期 2017-06-23
旧标准 (被替代) GB 4789.35-2010; SN/T 1941.1-2007
标准依据 National Health and Family Planning Commission Notice No.17 of 2016
发布机构 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会、国家食品药品监督管理总局

GB 4789.35-2016 National food safety standard -- Microbiological examination of food -- Examination of lactic acid bacteria 中华人民共和国国家标准 食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验 2016-12-23发布 2017-06-23实施 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会 国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 总 局 发 布 前言 本标准代替 GB 4789.35-2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》、 SN/T 1941.1-2007《进出口食品中乳酸菌检验方法 第1部分:分离与计数方法》。 本标准与GB 4789.35-2010相比,主要变化如下: ---增加了乳酸菌总数计数培养条件的选择及结果说明; ---修改了改良 MRS培养基成分; ---修改了平板计数的接种方法和接种量。 食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验 1 范围 本标准适用于含活性乳酸菌的食品中乳酸菌的检验。 2 术语和定义 2.1 乳酸菌 lacticacidbacteria 一类可发酵糖主要产生大量乳酸的细菌的通称。本标准中乳酸菌主要为乳杆菌属(Lactobacillus)、双 歧杆菌属(Bifidobacterium)和嗜热链球菌属(Streptococcus)。 3 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下: 3.1 恒温培养箱:36℃±1℃。 3.2 冰箱:2℃~5℃。 3.3 均质器及无菌均质袋、均质杯或灭菌乳钵。 3.4 天平:感量0.01g。 3.5 无菌试管:18mm×180mm、15mm×100mm。 3.6 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。 3.7 无菌锥形瓶:500mL、250mL。 4 培养基和试剂 4.1 生理盐水:见A.1。 Hydrochloride)改良 MRS培养基:见A.2和A.3。 4.3 MC培养基(ModifiedChalmers培养基):见A.4。 4.4 0.5%蔗糖发酵管:见A.5。 4.4 0.5%纤维二糖发酵管:见A.5。 4.6 0.5%麦芽糖发酵管:见A.5。 4.7 0.5%甘露醇发酵管:见A.5。 4.8 0.5%水杨苷发酵管:见A.5。 4.9 0.5%山梨醇发酵管:见A.5。 4.10 0.5%乳糖发酵管:见A.5。 4.11 七叶苷发酵管:见A.6。 4.12 革兰氏染色液:见A.7。 4.13 莫匹罗星锂盐(Li-Mupirocin):化学纯。 5 检验程序 乳酸菌检验程序见图1。 图1 乳酸菌检验程序图 6 操作步骤 6.1 样品制备 6.1.1 样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。 6.1.2 冷冻样品可先使其在2℃~5℃条件下解冻,时间不超过18h,也可在温度不超过45℃的条件 解冻,时间不超过15min。 6.1.3 固体和半固体食品:以无菌操作称取25g样品,置于装有225mL生理盐水的无菌均质杯内,于 8000r/min~10000r/min均质1min~2min,制成1∶10样品匀液;或置于225mL生理盐水的无菌 均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min制成1∶10的样品匀液。 6.1.4 液体样品:液体样品应先将其充分摇匀后以无菌吸管吸取样品25mL放入装有225mL生理盐 水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分振摇,制成1∶10的样品匀液。 6.2 步骤 6.2.1 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL,沿管壁缓慢注于装有9mL生理盐 水的无菌试管中(注意吸管尖端不要触及稀释液),振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均 匀,制成1∶100的样品匀液。 6.2.2 另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头,按上述操作顺序,做10倍递增样品匀液,每递增稀释 一次,即换用1次1mL灭菌吸管或吸头。 6.2.3 乳酸菌计数 6.2.3.1 乳酸菌总数 乳酸菌总数计数培养条件的选择及结果说明见表1。 表1 乳酸菌总数计数培养条件的选择及结果说明 样品中所包括乳酸菌菌属 培养条件的选择及结果说明 仅包括双歧杆菌属 按GB 4789.34的规定执行 仅包括乳杆菌属 按照6.2.3.4操作。结果即为乳杆菌属总数 仅包括嗜热链球菌 按照6.2.3.3操作。结果即为嗜热链球菌总数 同时包括双歧杆菌属和乳杆菌属 1) 按照6.2.3.4操作。结果即为乳酸菌总数; 2) 如需单独计数双歧杆菌属数目,按照6.2.3.2操作 同时包括双歧杆菌属和嗜热链球菌 1) 按照6.2.3.2和6.2.3.3操作,二者结果之和即为乳酸菌总数; 2) 如需单独计数双歧杆菌属数目,按照6.2.3.2操作 同时包括乳杆菌属和嗜热链球菌 1) 按照6.2.3.3和6.2.3.4操作,二者结果之和即为乳酸菌总数; 2) 6.2.3.3结果为嗜热链球菌总数; 3) 6.2.3.4结果为乳杆菌属总数 同时包括双歧杆菌属,乳杆菌属和嗜热链 球菌 1) 按照6.2.3.3和6.2.3.4操作,二者结果之和即为乳酸菌总数; 2) 如需单独计数双歧杆菌属数目,按照6.2.3.2操作 6.2.3.2 双歧杆菌计数 根据对待检样品双歧杆菌含量的估计,选择2个~3个连续的适宜稀释度,每个稀释度吸取1mL 样品匀液于灭菌平皿内,每个稀释度做两个平皿。稀释液移入平皿后,将冷却至48℃的莫匹罗星锂盐 和半胱氨酸盐酸盐改良的 MRS培养基倾注入平皿约15mL,转动平皿使混合均匀。36℃±1℃厌氧 培养72h±2h,培养后计数平板上的所有菌落数。从样品稀释到平板倾注要求在15min内完成。 6.2.3.3 嗜热链球菌计数 根据待检样品嗜热链球菌活菌数的估计,选择2个~3个连续的适宜稀释度,每个稀释度吸取 1mL样品匀液于灭菌平皿内,每个稀释度做两个平皿。稀释液移入平皿后,将冷却至48℃的 MC培 养基倾注入平皿约15mL,转动平皿使混合均匀。36℃±1℃需氧培养72h±2h,培养后计数。嗜热 链球菌在MC琼脂平板上的菌落特征为:菌落中等偏小,边缘整齐光滑的红色菌落,直径2mm±1mm,菌 落背面为粉红色。从样品稀释到平板倾注要求在15min内完成。 6.2.3.4 乳杆菌计数 根据待检样品活菌总数的估计,选择2个~3个连续的适宜稀释度,每个稀释度吸取1mL样品匀 液于灭菌平皿内,每个稀释度做两个平皿。稀释液移入平皿后,将冷却至48℃的 MRS琼脂培养基倾 注入平皿约15mL,转动平皿使混合均匀。36℃±1℃厌氧培养72h±2h。从样品稀释到平板倾注要 求在15min内完成。 6.3 菌落计数 注:可用肉眼观察,必要时用放大镜或菌落计数器,记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位 (colony-formingunits,CFU)表示。 6.3.1 选取菌落数在30CFU~300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU 的平板记录具体菌落数,大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的 平均数。 6.3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释 度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以 2,代表一个平板菌落数。 6.3.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时,则将每条单链作为一个菌落计数。 6.4 结果的表述 6.4.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内,计算两个平板菌落数的平均值,再将平 均值乘以相应稀释倍数,作为每克或每毫升中菌落总数结果。 6.4.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时,按式(1)计算: N= ∑ (n1+0.1n2)d (1) 式中: N ---样品中菌落数; ∑C---平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和; n1 ---第一稀释度(低稀释倍数)平板个数; n2 ---第二稀释度(高稀释倍数)平板个数; d ---稀释因子(第一稀释度)。 6.4.3 若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU,则对稀释度最高的平板进行计数,其他平板可 记录为多不可计,结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。 6.4.4 若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数 计算。 6.4.5 若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。 6.4.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU~300CFU之间,其中一部分小于30CFU或大于 300CFU时,则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。 6.5 菌落数的报告 6.5.1 菌落数小于100CFU时,按“四舍五入”原则修约,以整数报告。 6.5.2 菌落数大于或等于100CFU时,第3位数字采用“四舍五入”原则修约后,取前2位数字,后面用 0代替位数;也可用10的指数形式来表示,按“四舍五入”原则修约后,采用两位有效数字。 6.5.3 称重取样以CFU/g为单位报告,体积取样以CFU/mL为单位报告。 7 结果与报告 根据菌落计数结果出具报告,报告单位以CFU/g(mL)表示。 8 乳酸菌的鉴定(可选做) 8.1 纯培养 挑取3个或以上单个菌落,嗜热链球菌接种于 MC琼脂平板,乳杆菌属接种于 MRS琼脂平板,置 36℃±1℃厌氧培养48h。 8.2 鉴定 8.2.1 双歧杆菌的鉴定按GB 4789.34的规定操作。 8.2.2 涂片镜检:乳杆菌属菌体形态多样,呈长杆状、弯曲杆状或短杆状。无芽胞,革兰氏染色阳性。 嗜热链球菌菌体呈球形或球杆状,直径为0.5μm~2.0μm,成对或成链排列,无芽胞,革兰氏染色阳性。 8.2.3 乳酸菌菌种主要生化反应见表2和表3。 表2 常见乳杆菌属内种的碳水化合物反应 菌种 七叶苷 纤维二糖 麦芽糖 甘露醇 水杨苷 山梨醇 蔗糖 棉子糖 干酪乳杆菌干酪亚种(L.caseisubsp. casei) + + + + + + + - 德氏乳杆菌保加利亚种(L.delbrueckii - - - - - - - - 嗜酸乳杆菌(L.acidophilus) + + + - + - + d 罗伊氏乳杆菌(L.reuteri) ND - + - - - + + 鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus) + + + + + + + - 植物乳杆菌(L.plantarum) + + + + + + + + 注:+表示90%以上菌株阳性;-表示90%以上菌株阴性;d表示11%~89%菌株阳性;ND表示未测定。 表3 嗜热链球菌的主要生化反应 菌种 菊糖 乳糖 甘露醇 水杨苷 山梨醇 马尿酸 七叶苷 嗜热链球菌(S.thermophilus) - + - - - - - 注:+表示90%以上菌株阳性;-表示90%以上菌株阴性。 附 录 A 培养基及试剂 A.1 生理盐水 A.1.1 成分 NaCl 8.5g A.1.2 制法 将上述成分加入到1000mL蒸馏水中,加热溶解,分装后121℃高压灭菌15min~20min。 A.2 MRS培养基 A.2.1 成分 蛋白胨 10.0g 牛肉粉 5.0g 酵母粉 4.0g 葡萄糖 20.0g 吐温80 1.0mL K2HPO4·7H2O 2.0g 醋酸钠·3H2O 5.0g 柠檬酸三铵 2.0g MgSO4·7H2O 0.2g MnSO4·4H2O 0.05g 琼脂粉 15.0g A.2.2 制法 将上述成分加入到1000mL蒸馏水中,加热溶解,调节pH至6.2±0.2,分装后121℃高压灭菌 15min~20min。 A.3 莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良 MRS培养基 A.3.1 莫匹罗星锂盐储备液制备:称取50mg莫匹罗星锂盐加入到50mL蒸馏水中,用0.22μm微孔 滤膜过滤除菌。 A.3.2 半胱氨酸盐酸盐储备液制备:称取250mg半胱氨酸盐酸盐加入到50mL蒸馏水中,用0.22μm微 孔滤膜过滤除菌。 A.3.3 制法 将A.2.1成分加入到950mL蒸馏水中,加热溶解,调节pH,分装后121℃高压灭菌15min~20min。 临用时加热熔化琼脂,在水浴中冷至48℃,用带有0.22μm微孔滤膜的注射器将莫匹罗星锂盐储备液 及半胱氨酸盐酸盐储备液制备加入到熔化琼脂中,使培养基中莫匹罗星锂盐的浓度为50μg/mL,半胱 氨酸盐酸盐的浓度为500μg/mL。 A.4 MC培养基 A.4.1 成分 大豆蛋白胨 5.0g 牛肉粉 3.0g 酵母粉 3.0g 葡萄糖 20.0g 乳糖 20.0g 碳酸钙 10.0g 琼脂 15.0g 蒸馏水 1000mL 1%中性红溶液 5.0mL A.4.2 制法 将前面7种成分加入蒸馏水中,加热溶解,调节pH至6.0±0.2,加入中性红溶液。分装后121℃ 高压灭菌15min~20min。 A.5 乳酸杆菌糖发酵管 A.5.1 基础成分 牛肉膏 5.0g 蛋白胨 5.0g 酵母浸膏 5.0g 吐温80 0.5mL 琼脂 1.5g 1.6%溴甲酚紫酒精溶液 1.4mL 蒸馏水 1000mL A.5.2 制法 按0.5%加入所需糖类,并分装小试管,121℃高压灭菌15min~20min。 A.6 七叶苷培养基 A.6.1 成分 蛋白胨 ......