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| 标准编号 | GB 4789.40-2016 (GB4789.40-2016) | | 中文名称 | 食品安全国家标准 食品微生物学检验 克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验 | | 英文名称 | National food safety standard - Food Microbiological Examination - Examination of Cronobacter (Enterobacter Sakazakii) | | 行业 | 国家标准 | | 中标分类 | C53 | | 字数估计 | 12,158 | | 发布日期 | 2016-12-23 | | 实施日期 | 2017-06-23 | | 旧标准 (被替代) | GB 4789.40-2010; SN/T 1632.1-2013 | | 标准依据 | National Health and Family Planning Commission Notice No.17 of 2016 | | 发布机构 | 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会、国家食品药品监督管理总局 | GB 4789.40-2016
National Food Safety Standard -- Food Microbiological Examination -- Examination of Cronobacter (Enterobacter Sakazakii)
中华人民共和国国家标准
食品安全国家标准
食品微生物学检验
克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验
2016-12-23发布
2017-06-23实施
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会
国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 总 局 发 布
前言
本标准代替 GB 4789.40-2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 阪崎肠杆菌检验》、
SN/T 1632.1-2013《出口奶粉中阪崎肠杆菌(克罗诺杆菌属)检验方法 第1部分:分离与计数》。
本标准与GB 4789.40-2010相比,主要变化如下:
---标准名称修改为“食品安全国家标准 食品微生物学检验 克罗诺杆菌属(阪崎肠杆
菌)检验”;
---修改了可疑菌落的挑取数量。
食品安全国家标准
食品微生物学检验
克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验
1 范围
本标准规定了食品中克罗诺杆菌属(Cronobacter)的检验方法。
本标准适用于婴幼儿配方食品、乳和乳制品及其原料中克罗诺杆菌属的检验。
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
2.1 恒温培养箱:25℃±1℃,36℃±1℃,44℃±0.5℃。
2.2 冰箱:2℃~5℃。
2.3 恒温水浴箱:44℃±0.5℃。
2.4 天平:感量0.1g。
2.5 均质器。
2.6 振荡器。
2.7 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。
2.8 无菌锥形瓶:容量100mL、200mL、2000mL。
2.9 无菌培养皿:直径90mm。
2.10 pH计或pH比色管或精密pH试纸。
2.11 全自动微生物生化鉴定系统。
3 培养基和试剂
3.1 缓冲蛋白胨水(bufferpeptonewater,BPW):见A.1。
medium,mLST-Vm):见A.2。
3.3 阪崎肠杆菌显色培养基。
3.4 胰蛋白胨大豆琼脂(trypticasesoyagar,TSA):见A.3。
3.5 生化鉴定试剂盒。
3.6 氧化酶试剂:见A.4。
3.7 L-赖氨酸脱羧酶培养基:见A.5。
3.8 L-鸟氨酸脱羧酶培养基:见A.6。
3.9 L-精氨酸双水解酶培养基:见A.7。
3.10 糖类发酵培养基:见A.8。
3.11 西蒙氏柠檬酸盐培养基:见A.9。
第一法 克罗诺杆菌属定性检验
4 检验程序
克罗诺杆菌属检验程序见图1。
图1 克罗诺杆菌属检验程序
5 操作步骤
5.1 前增菌和增菌
取检样100g(mL)置灭菌锥形瓶中,加入900mL已预热至44℃的缓冲蛋白胨水,用手缓缓地摇
动至充分溶解,36℃±1℃培养18h±2h。移取1mL转种于10mLmLST-Vm肉汤,44℃±0.5℃
培养24h±2h。
5.2 分离
5.2.1 轻轻混匀mLST-Vm肉汤培养物,各取增菌培养物1环,分别划线接种于两个阪崎肠杆菌显色
培养基平板,显色培养基须符合GB 4789.28的要求,36℃±1℃培养24h±2h,或按培养基要求条件
培养。
5.2.2 挑取至少5个可疑菌落,不足5个时挑取全部可疑菌落,划线接种于TSA平板。25℃±1℃培
养48h±4h。
5.3 鉴定
自TSA平板上直接挑取黄色可疑菌落,进行生化鉴定。克罗诺杆菌属的主要生化特征见表1。可
选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统。
表1 克罗诺杆菌属的主要生化特征
生化试验 特 征
黄色素产生 +
氧化酶 -
L-赖氨酸脱羧酶 -
L-鸟氨酸脱羧酶 (+)
L-精氨酸双水解酶 +
柠檬酸水解 (+)
发酵
D-山梨醇
L-鼠李糖
D-蔗糖
D-蜜二糖
苦杏仁甙
(-)
注:+ >99%阳性;- >99%阴性;(+)90%~99%阳性;(-)90%~99%阴性。
6 结果与报告
综合菌落形态和生化特征,报告每100g(mL)样品中检出或未检出克罗诺杆菌属。
第二法 克罗诺杆菌属的计数
7 操作步骤
7.1 样品的稀释
7.1.1 固体和半固体样品:无菌称取样品100g、10g、1g各三份,分别加入900mL、90mL、9mL已预
热至44℃的BPW,轻轻振摇使充分溶解,制成1∶10样品匀液,置36℃±1℃培养18h±2h。分别移
取1mL转种于10mLmLST-Vm肉汤,44℃±0.5℃培养24h±2h。
7.1.2 液体样品:以无菌吸管分别取样品100mL、10mL、1mL各三份,分别加入900mL、90mL、
9mL已预热至44℃的BPW,轻轻振摇使充分混匀,制成1∶10样品匀液,置36℃±1℃培养18h±
2h。分别移取1mL转种于10mLmLST-Vm肉汤,44℃±0.5℃培养24h±2h。
7.2 分离、鉴定
同5.2和5.3。
8 结果与报告
综合菌落形态、生化特征,根据证实为克罗诺杆菌属的阳性管数,查 MPN检索表,报告每100g
(mL)样品中克罗诺杆菌属的 MPN值(见表B.1)。
附 录 A
培养基和试剂
A.1 缓冲蛋白胨水(BPW)
A.1.1 成分
蛋白胨 10.0g
氯化钠 5.0g
磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O) 9.0g
磷酸二氢钾 1.5g
蒸馏水 1000mL
A.1.2 制法
加热搅拌至溶解,调节pH至7.2±0.2,121℃高压灭菌15min。
A.2.1 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨(mLST)肉汤
A.2.1.1 成分
氯化钠 34.0g
胰蛋白胨 20.0g
乳糖 5.0g
磷酸二氢钾 2.75g
磷酸氢二钾 2.75g
十二烷基硫酸钠 0.1g
蒸馏水 1000mL
A.2.1.2 制法
加热搅拌至溶解,调节pH至6.8±0.2。分装每管10mL,121℃高压灭菌15min。
A.2.2 万古霉素溶液
A.2.2.1 成分
万古霉素 10.0mg
蒸馏水 10.0mL
A.2.2.2 制法
10.0mg万古霉素溶解于10.0mL蒸馏水,过滤除菌。万古霉素溶液可以在0℃~5℃保存15d。
medium,mLST-Vm)
每10mLmLST加入万古霉素溶液0.1mL,混合液中万古霉素的终浓度为10μg/mL。
注:mLST-Vm必须在24h之内使用。
A.3 胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)
A.3.1 成分
胰蛋白胨 15.0g
植物蛋白胨 5.0g
氯化钠 5.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 1000mL
A.3.2 制法
加热搅拌至溶解,煮沸1min,调节pH至7.3±0.2,121℃高压15min。
A.4 氧化酶试剂
A.4.1 成分
N,N,N',N'-四甲基对苯二胺盐酸盐 1.0g
蒸馏水 100mL
A.4.2 制法
少量新鲜配制,于冰箱内避光保存,在7d之内使用。
A.4.3 试验方法
用玻璃棒或一次性接种针挑取单个特征性菌落,涂布在氧化酶试剂湿润的滤纸平板上。如果滤纸
在10s中之内未变为紫红色、紫色或深蓝色,则为氧化酶试验阴性,否则即为氧化酶实验阳性。
注:实验中切勿使用镍/铬材料。
A.5 L-赖氨酸脱羧酶培养基
A.5.1 成分
酵母浸膏 3.0g
葡萄糖 1.0g
溴甲酚紫 0.015g
蒸馏水 1000mL
A.5.2 制法
将各成分加热溶解,必要时调节pH至6.8±0.2。每管分装5mL,121℃高压15min。
A.5.3 实验方法
挑取培养物接种于L-赖氨酸脱羧酶培养基,刚好在液体培养基的液面下。30℃±1℃培养24h±
2h,观察结果。L-赖氨酸脱羧酶试验阳性者,培养基呈紫色,阴性者为黄色,空白对照管为紫色。
A.6 L-鸟氨酸脱羧酶培养基
A.6.1 成分
酵母浸膏 3.0g
葡萄糖 1.0g
溴甲酚紫 0.015g
蒸馏水 1000mL
A.6.2 制法
将各成分加热溶解,必要时调节pH至6.8±0.2。每管分装5mL。121℃高压15min。
A.6.3 实验方法
挑取培养物接种于L-鸟氨酸脱羧酶培养基,刚好在液体培养基的液面下。30℃±1℃培养24h±
2h,观察结果。L-鸟氨酸脱羧酶试验阳性者,培养基呈紫色,阴性者为黄色。
A.7 L-精氨酸双水解酶培养基
A.7.1 成分
酵母浸膏 3.0g
葡萄糖 1.0g
溴甲酚紫 0.015g
蒸馏水 1000mL
A.7.2 制法
将各成分加热溶解,必要时调节pH至6.8±0.2。每管分装5mL。121℃高压15min。
A.7.3 实验方法
挑取培养物接种于L-精氨酸脱羧酶培养基,刚好在液体培养基的液面下。30℃±1℃培养24h±
2h,观察结果。L-精氨酸脱羧酶试验阳性者,培养基呈紫色,阴性者为黄色。
A.8 糖类发酵培养基
A.8.1 基础培养基
A.8.1.1 成分
酪蛋白(酶消化) 10.0g
氯化钠 5.0g
酚红 0.02g
蒸馏水 1000mL
A.8.1.2 制法
将各成分加热溶解,必要时调节pH至6.8±0.2。每管分装5mL。121℃高压15min。
A.8.2 糖类溶液(D-山梨醇、L-鼠李糖、D-蔗糖、D-蜜二糖、苦杏仁甙)
A.8.2.1 成分
糖 8.0g
蒸馏水 100mL
A.8.2.2 制法
分别称取D-山梨醇、L-鼠李糖、D-蔗糖、D-蜜二糖、苦杏仁甙等糖类成分各8g,溶于100mL蒸馏水
中,过滤除菌,制成80mg/mL的糖类溶液。
A.8.3 完全培养基
A.8.3.1 成分
基础培养基 875mL
糖类溶液 125mL
A.8.3.2 制法
无菌操作,将每种糖类溶液加入基础培养基,混匀;分装到无菌试管中,每管10mL。
A.8.4 实验方法
挑取培养物接种于各种糖类发酵培养基,刚好在液体培养基的液面下。30℃±1℃培养24h±
2h,观察结果。糖类发酵试验阳性者,培养基呈黄色,阴性者为红色。
A.9 西蒙氏柠檬酸盐培养基
A.9.1 成分
柠檬酸钠 2.0g
氯化钠 5.0g
磷酸氢二钾 1.0g
磷酸二氢铵 1.0g
硫酸镁 0.2g
溴麝香草酚蓝 0.08g
琼脂 8.0g~18.0g
蒸馏水 1000mL
A.9.2 制法
将各成分加热溶解,必要时调节pH至6.8±0.2。每管分装10mL,121℃高压15min,制成斜面。
A.9.3 实验方法
挑取培养物接种于整个培养基斜面,36℃±1℃培养24h±2h,观察结果。阳性者培养基变为
蓝色。
附 录 B
克罗诺杆菌属最可能数(MPN)检索表
每100g(mL)检样中克罗诺杆菌属最可能数(MPN)的检索见表B.1。
表B.1 克罗诺杆菌属最可能数(MPN)检索表
阳性管数
MPN
95%可信限
下限 上限
阳性管数
MPN
95%可信限
下限 上限
0 0 0 < 0.3 - 0.95 2 2 0 2.1 0.45 4.2
0 0 1 0.3 0.015 0.96 2 2 1 2.8 0.87 9.4
0 1 0 0.3 0.015 1.1 2 2 2 3.5 0.87 9.4
0 1 1 0.61 0.12 1.8 2 3 0 2.9 0.87 9.4
0 2 0 0.62 0.12 1.8 2 3 1 3.6 0.87 9.4
0 3 0 0.94 0.36 3.8 3 0 0 2.3 0.46 9.4
1 0 0 0.36 0.017 1.8 3 0 1 3.8 0.87 11
1 0 1 0.72 0.13 1.8 3 0 2 6.4 1.7 18
1 0 2 1.1 0.36 3.8 3 1 0 4.3 0.9 18
1 1 0 0.74 0.13 2 3 1 1 7.5 1.7 20
1 1 1 1.1 0.36 3.8 3 1 2 12 3.7 42
1 2 0 1.1 0.36 4.2 3 1 3 16 4 42
1 2 1 1.5 0.45 4.2 3 2 0 9.3 1.8 42
1 3 0 1.6......
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