标准搜索结果: 'GB/T 4789.9-2008'
| 标准编号 | GB/T 4789.9-2008 (GB/T4789.9-2008) | | 中文名称 | 食品卫生微生物学检验 空肠弯曲菌检验 | | 英文名称 | Microbiological examination of food hygiene -- Examination of campylobacter jejuni | | 行业 | 国家标准 (推荐) | | 中标分类 | C53 | | 国际标准分类 | 07.100.30 | | 字数估计 | 15,163 | | 发布日期 | 2008-11-21 | | 实施日期 | 2009-03-01 | | 旧标准 (被替代) | GB/T 4789.9-2003 | | 采用标准 | ISO 10272-1-2006, MOD | | 标准依据 | 国家标准批准发布公告2008年第22号(总第135号);国家卫生计生委公告2014年第19号 | | 发布机构 | 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局、中国国家标准化管理委员会 | | 范围 | 本标准规定了食品中空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni) 的检验方法。本标准适用于食品和食源性疾病样品中空肠弯曲菌的检验。 | GB/T 4789.9-2008: 食品卫生微生物学检验 空肠弯曲菌检验
1 范围
本标准规定了食品中空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)的检验方法。本标准适用于食品和食源性疾病样品中空肠弯曲菌的检验。
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌与培养设备外，其他设备与材料如下：
2.1 冰箱：2℃～8℃。
2.2 恒温培养箱：25℃±1℃,36℃±1℃,42℃±1℃。
2.3 恒温振荡培养箱：36℃±1℃,42℃±1℃。
2.4 水浴装置：36℃±1℃,100℃。
2.5微需氧培养装置：提供微需氧条件(5%氧气、10%二氧化碳和85%氮气)。
2.6 均质器。
2.7 电子天平：感量0.1g。
2.8 过滤装置及滤膜(0.22 μm,0.45 μm)。
2.9 显微镜：10×～100×,有相差功能。
2.10离心机：离心力≥20000×g。
2.11 全自动微生物鉴定系统(VITEK 2)”。
2.12 全自动酶联荧光免疫分析仪(VIDAS或mini VIDAS)"。
3 培养基和试剂
3.1 Bolton肉汤：按第A.1章规定。
3.2 改良CCD(mCCD)琼脂：按第A.2章规定。
3.3 哥伦比亚琼脂：按第A.3章规定。
3.4 布氏肉汤：按第A.4章规定。
3.5 氧化酶试剂：按第A.5章规定。
3.6 马尿酸钠水解试剂：按第A.6章规定。
3.7 Mueller Hinton琼脂：按第A.7章规定。
3.8 吲哚乙酸酯纸片：按第A.8章规定。
3.9 Skirrow琼脂：按第A.9章规定。
3.100.1%蛋白胨水：按第A.10章规定。
3.11 CFA显色平板”。
3.12 1 mol/L碳酸氢钠(NaHCO₃)溶液。
3.13 3%过氧化氢溶液。
3.14 APICampy生化鉴定试剂盒”。
3.15 VITEK2 NH生化鉴定卡”。
1) 由法国生物梅里埃(bioMerieux)公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。
4 检验程序
空肠弯曲菌检验程序见图1。
5 操作步骤
5.1 样品处理
5.1.1一般样品
取25 g(或25mL)样品(水果、蔬菜、水产品为50g)加入盛有100 mL Bolton肉汤的有滤网的均质袋中(无滤网的均质袋可使用无菌纱布过滤),用拍击式均质器均质1 min~2 min;或加入盛有100 mLBolton肉汤的均质杯中，以8000 r/min～10000 r/min均质1min~2 min,经滤网或无菌纱布过滤。将滤液进行培养。
5.1.2 鲜乳、冰淇淋、奶酪等
取50g样品加入盛有50mL0.1%蛋白胨水的有滤网均质袋中，必要时调整pH值至7.2±0.2,用拍击式均质器均质15 s～30 s,将滤液以20000×g离心30 min后弃去上清，用10mLBolton肉汤悬浮沉淀(尽量避免带入油层),再转移至90mL不含抗生素的Bolton肉汤进行培养。
5.1.3 贝类
取至少12个带壳样品，除去外壳后将所有内容物放到均质袋中，用拍击式均质器均质1 min～2 min,取25g样品于225mL Bolton肉汤中(1:10稀释),再转移25 mL～225 mL Bolton肉汤中
(1:100稀释),将1:10和1:100稀释的Bolton肉汤同时进行培养。
5.1.4 蛋黄液或蛋浆
取25 g(或25 mL)样品于125mL Bolton肉汤中并搅匀(116稀释),再转移25 mL～100mLBolton肉汤中并搅匀(1:30稀释),同时将1:6和1:30稀释的Bolton肉汤进行培养。
5.1.5 整盘等样品
用200mL0.1%的蛋白胨水充分冲洗样品的内外部，并振荡2 min～3 min,经无菌纱布过滤至250 mL离心管中，16000×g离心15 min后弃去上清，用10mL0.1%蛋白胨水悬浮沉淀，吸取3mL～100 mL Bolton肉汤中进行培养。
5.1.6需表面涂拭检测的样品
无菌棉签涂布样品表面(面积为50cm²～100 cm³),将棉签头剪落到100 mL Bolton肉汤中进行培养。
5.1.7水样
将4L的水(对于氯处理的水，在过滤前每升水中加入5mL1mol/L硫代硫酸钠溶液)经0.45μm滤膜过滤，将滤膜浸没在100mL Bolton肉汤中进行培养。
5.2预增菌与增菌
在微需氧条件下，以100 r/min的振荡速度，36 ℃±1℃培养4 h。必要时测定增菌液的pH值并
调整至7.2±0.2。42℃±1℃继续培养48 h。
5.3 分离
将24h增菌液、48h增菌液以及相应的1:50稀释液分别划线接种于Skirrow与mCCD琼脂平板上，微需氧条件下42℃±1℃培养24h~48 h。另外，可同时选择使用CFA显色平板。
观察24h培养与48h培养的琼脂平板上的菌落形态。mCCD琼脂平板上的可疑菌落通常有光泽、潮湿、扁平，呈扩散生长的倾向，直径约为1mm～2 mm。Skirrow琼脂平板上的可疑菌落为灰色、扁平、湿润有光泽，呈沿接种线向外扩散的倾向；有些可疑菌落常呈分散凸起的单个菌落，直径约1mm~2mm,边缘整齐、发亮。CFA显色平板上的可疑菌落为红色、突起、湿润，菌落直径约为2mm~3mm,边缘有一圈红色的透明环，中间有一个圆形的、不透明、颜色较深的红色小点的菌落。
5.4 鉴定
5.4.1 弯曲菌属的鉴定
挑取5个或更多的可疑菌落接种到哥伦比亚琼脂平板上，微需氧条件下42℃±1℃培养24 h~48 h,按照5.4.1.1～5.4.1.5进行鉴定，结果符合表1的可疑菌落确定为弯曲菌属。
5.4.1.1 形态观察
挑取可疑菌落进行革兰氏染色，镜检。
5.4.1.2 动力观察
挑取可疑菌落用1mL布氏肉汤悬浮，用相差显微镜观察运动状态。
5.4.1.3氧化酶试验
用铂/铱接种环或玻璃棒挑取可疑菌落至氧化酶试剂润湿的滤纸上，如果在10s内出现紫红色、紫罗兰或深蓝色为阳性。
5.4.1.4微需氧条件下25℃±1℃生长试验
挑取可疑菌落，接种到哥伦比亚琼脂平板上，微需氧条件下25 ℃±1℃培养44h±4 h,观察细菌生长情况。
5.4.1.5有氧条件下42℃±1℃生长试验
挑取可疑菌落，接种到哥伦比亚琼脂平板上，有氧条件下42℃±1℃培养44 h±4h,观察细菌生长情况。
5.4.2空肠弯曲菌的鉴定
5.4.2.1过氧化氢酶试验：挑取菌落，加到干净玻片上的3%过氧化氢溶液中，如果在30 s内出现气泡则判定结果为阳性。
5.4.2.2马尿酸钠水解试验：挑取菌落，加到盛有0.4mL1%马尿酸钠的试管中制成菌悬液。混合均匀后在36℃±1℃水浴放置2h或36℃±1℃培养箱中放置4h。沿着试管壁缓缓加入0.2 mL茚三酮溶液，不要振荡，在36℃±1℃的水浴或培养箱中放置10 min后判读结果。若出现深紫色则为阳性；若出现淡紫色或没有颜色变化则为阴性。
5.4.2.3吲哚乙酸酯水解试验：挑取菌落至吲哚乙酸酯纸片上，再滴加一滴灭菌水。如果吲哚乙酸酯水解，则在5min～10min内出现深蓝色；若无颜色变化则没有发生水解。
5.4.2.4药物敏感性试验(可选择):挑取菌落，在布氏肉汤中制备成浓度为0.5 McFarland的菌悬液，
再用布氏肉汤制备1:10的稀释液，在5%Mueller Hinton琼脂平板上进行涂布，静置5 min后去除多余液体，将平板在36℃±1℃培养箱中放置10 min进行干燥。将头孢霉素(30μg)和萘啶酮酸(30μg)药敏纸片放在琼脂表面。将平板在微需氧条件下36 ℃±1℃培养22 h±2 h。如果细菌紧贴着纸片生长则为有抗性；如果纸片周围出现不同程度的细菌抑制生长则为敏感。空肠弯曲菌的鉴定结果见表2。
5.4.2.5对于确定为弯曲菌属的菌落，可使用API Campy生化鉴定试剂盒或VITEK 2 NH生化鉴定
卡来替代5.4.2.1～5.4.2.4的鉴定，具体操作按照产品说明书进行。
5.5 结果报告
综合以上试验结果，报告检样单位中检出空肠弯曲菌或未检出空肠弯曲菌。
第二法 全自动酶联荧光免疫分析仪筛选法
6 原理
弯曲菌的酶联荧光免疫筛选法是在全自动酶联荧光免疫分析仪上进行的双抗体夹心酶联荧光免疫检验方法。固相容器(SPR)用抗弯曲菌抗体包被，各种试剂均封闭在试剂条内。煮沸过的增菌肉汤加入试条孔，在特定时间内样本在SPR内外反复循环，使得弯曲菌抗原与包被在SPR内部的弯曲菌抗体结合，洗涤去除未结合的其他成分。接着标记有破性磷酸酶的抗体与固定在SPR壁上的弯曲菌抗原相结合，洗去未结合的抗体标记物。结合在SPR壁上的碱性磷酸酶将催化底物磷酸4-甲基伞型物转变成具有荧光的4-甲基伞形酮，以450 nm波长处检测荧光强度，由仪器分析后得出检验结果。
7 仪器
mini VIDAS或VIDAS.
8试剂
8.1 弯曲菌试剂条(VIDAS CAM)。
8.2校正液：纯化灭活的弯曲菌抗原标准溶液。
8.3 阳性对照。
8.4 阴性对照。
8.5 MLE卡。
9操作步骤
9.1 增菌......
|