[PDF] SN/T 5100-2019 - 英文版
| 标准号码 | 美元 | 购买PDF | 工期 | 标准名称(英文版) |
| SN/T 5100-2019 | 179 | SN/T 5100-2019 | <=3 | 国境口岸卡萨诺尔森林病病毒实时荧光RT-PCR检测方法 |
| 基本信息 | |
|---|---|
| 标准编号 | SN/T 5100-2019 (SN/T5100-2019) |
| 中文名称 | 国境口岸卡萨诺尔森林病病毒实时荧光RT-PCR检测方法 |
| 英文名称 | Detection method for Kyasanur Forest disease virus by real-time fluorescence RT-PCR at frontier ports |
| 行业 | 商检行业标准 (推荐) |
| 中标分类 | C62 |
| 国际标准分类 | |
| 字数估计 | 8,826 |
| 发布日期 | 2019-09-03 |
| 实施日期 | 2020-03-01 |
| 标准依据 | 海关总署公告2019年第142号 |
| 发布机构 | 海关总署 |
SN/T 5100-2019: 国境口岸卡萨诺尔森林病病毒实时荧光RT-PCR检测方法
SN/T 5100-2019 英文名称: Detection method for Kyasanur Forest disease virus by real-time fluorescence RT-PCR at frontier ports
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
国境口岸卡萨诺尔森林病病毒实时
荧光RT-PCR检测方法
中华人民共和国海关总署 发 布
前言
本标准根据GB/T １．１-２００９给出的规则起草。
本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。
本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、杭州富集生物科技有限公司、新疆国际旅行卫生保健
中心。
本标准主要起草人：马雪征、张丽萍、杨烨、胡孔新、孙肖红。
国境口岸卡萨诺尔森林病病毒实时
荧光RT-PCR检测方法
１ 范围
本标准规定了国境口岸卡萨诺尔森林病病毒检测的生物安全要求、标本的采集、运输和保存、标本
的处理，卡萨诺尔森林病病毒实时荧光ＲＴ-ＰＣＲ检测方法。
本标准适用于国境口岸入出境人员携带卡萨诺尔森林病病毒的核酸检测。
２ 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本
文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB １９４８９ 实验室生物安全通用要求
ＷＳ/T ２３０ 临床诊断中聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术的应用
病原微生物实验室生物安全通用准则
可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定 （原中华人民共和国卫生部令
第４５号）
人间传染的病原微生物菌（毒）种保藏机构管理办法（原中华人民共和国卫生部）
人间传染的病原微生物名录（原中华人民共和国卫生部）
４ 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
ＤＥＰＣ：焦碳酸乙二酯（ｄｉｅｔｈｙｌｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）
ＦＡＭ：６-羧基一荧光素（６-ｃａｒｂｏｘｙ-ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）
ＢＨＱ１：黑洞淬灭基团（ｂｌａｃｋｈｏｌｅｑｕｅｎｃｈｅｒ１）
５ 检测对象
出入境口岸发现的可疑病例。
６ 实验室生物安全和PCR防污染要求
按照GB １９４８９、《人间传染的病原微生物名录》和《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》的要求，相关材料的生物安全要求如下：
---卡萨诺尔森林病病毒危害程度分类为第一类；
---实验室应遵循GB １９４８９和 ＷＳ２３３，未经培养的感染性材料的操作应在生物安全Ⅲ级（ＢＳＬ-３或ＡＢＳＬ-３）实验室内进行，灭活材料在生物安全Ⅱ级（ＢＳＬ-２）实验室内进行；
---卡萨诺尔森林病病毒感染性材料运输包装分类为Ａ类，ＵＮ编号为ＵＮ２８１４；
---使用过的实验用品应遵照GB １９４８９对废弃物的处理要求进行无害化处理：
---疑似卡萨诺尔森林病病毒材料的包装及转运应符合原中华人民共和国卫生部第４５号令；
---ＰＣＲ防污染措施按照 ＷＳ/T ２３０的规定执行。
７ 仪器
本方法使用的主要仪器如下：
---实时荧光ＰＣＲ仪；
---超净工作台；
---二级生物安全柜；
---高压灭菌锅；
---低温高速离心机：最大离心力２００００ｓ：
---漩涡振荡器；
---冰箱：４℃、-２０℃和-７０℃；
---移液器：１０μＬ、２０μＬ、１００μＬ、２００μＬ和１ｍＬ；---恒温水浴锅；
---无菌注射器。
８ 试剂
本方法使用的主要试剂如下：
---核酸提取试剂：用德国Ｑｉａｇｅｎ公司ＱＩＡａｍｐＶｉｒａｌＲＮＡＫｉｔ提取病毒核酸１）；
---实时荧光ＲＴ-ＰＣＲ试剂：Ａｇ-Ｐａｔｈ-ＩＤＴＭ ＯｎｅｓｔｅｐＲＴ-ＰＣＲＫｉｔ２）；
---无ＲＮＡ酶的ＤＥＰＣ水：
---引物和探针序列见表１。
９ 检测程序
９．１ 标本的采集
无菌采集发病后５天内静脉血３～５ｍＬ，５００ｇ离心１０ｍｉｎ，收集血清于２ｍＬ无菌螺口塑料管中，
用耐低温油性记号笔对采集的样本进行编号登记。
９．２ 标本的保存
采集的标本应保存在４℃条件下，样本保存的生物安全要求应按照《人间传染的病原微生物菌（毒）
种保藏机构管理办法》。
９．３ 标本的转运
疑似卡萨诺尔森林病病毒感染材料的包装及转运应符合《可感染人类的高致病性病原微生物菌
（毒）种或样本运输管理规定》。
９．４ 核酸提取
９．４．１ 核酸的提取按照商品化核酸提取试剂盒进行。将采集的样本平衡至室温静置１０ｍｉｎ，取１４０μＬ上清液进行试验。
９．４．２ 用移液器吸取３１０μＬＡＶＬ加入到３１０μｇ的ＣａｒｒｉｅｒＲＮＡ中，使ＣａｒｒｉｅｒＲＮＡ彻底溶解，得到终浓度为１μｇ／μＬ的ＣａｒｒｉｅｒＲＮＡ水溶液。９．４．３ 根据样本的数量（ｎ），先吸取裂解液（ｎ×０．５６）ｍＬ，再吸取ＣａｒｒｉｅｒＲＮＡ水溶液（ｎ×５．６）μＬ将两者进行充分混匀，每管分装０．５６ｍＬ。（注：剩余ＣａｒｒｉｅｒＲＮＡ水溶液应及时分装到无核酸酶的离心管
中，-２０℃保存，避免反复冻融）。
９．４．４ 向每管ＣａｒｒｉｅｒＲＮＡ-裂解缓冲液中加入１４０μＬ的样本，混匀后旋振荡１５ｓ。
１）和２）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产
品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。
９．４．５ 在室温下静置１０ｍｉｎ后，短暂离心。
９．４．６ 加入５６０μＬ的无水乙醇，并涡旋振荡１５ｓ。
９．４．７ 短暂离心后，吸取离心管中的６３０μＬ混合液（包括ＣａｇｉｅｒＲＮＡ裂解缓冲液、采集液及无水乙醇），转移到带有离心管的吸附柱内，以６０００ｇ离心１ｍｉｎ。
９．４．８ 弃掉废液，将吸附柱放回收集管，将剩余的６３０μＬ混合液转移至带有离心管的吸附柱内，以６０００ｇ离心１ｍｉｎ。
９．４．９ 弃掉废液，将吸附柱放回收集管并向吸附柱内加入缓冲液ＡＷ１（使用前检查是否己加入无水乙
醇）５００μＬ，盖上盖子，６０００ｇ离心１ｍｉｎ。９．４．１０ 弃掉废液，将吸附柱放回收集管并向吸附柱内加入漂洗液ＡＷ２（使用前检查是否已加入无水
乙醇）５００μＬ，１３４００ｇ离心１ｍｉｎ。９．４．１１ 弃掉废液，将吸附柱放回收集管，１３４００ｇ离心３０ｓ，弃掉废液。
９．４．１２ 将吸附柱放置在一支无核酸酶的离心管上，并向离心柱内加入６０μＬ的无核酸酶的水，室温静置２ｍｉｎ。
９．４．１３ 以１３４００ｇ，离心２ｍｉｎ，弃掉吸附柱，离心管内的液体即为病毒的核酸水溶液，做好标记，
-８０℃保存待用。
９．５ 实时荧光ＲＴ-ＰＣＲ检测体系
实时荧光ＲＴ-ＰＣＲ反应体系配置（在体系配置区），按表２中的顺序，依次加入：
９．７ 结果分析
９．７．１ 阈值确定
阈值确定的方法对所有的标本都是统一的，一般是以实时荧光ＰＣＲ反应的前３～１５个循环的荧光
信号作为荧光本底信号，以本底信号标准差的１０倍作为荧光阈值，以标本扩增产生的实时荧光信号达
到荧光阈值时所对应的循环数为循环阈值（Ｃｔ值）。
９．７．２ 质量控制
反应结果应同时符合以下两个条件：
---阴性对照无扩增曲线，Ｃｔ值应显示无扩增曲线或≥４０；
---阳性对照Ｃｔ值＜３５并有明显的扩增曲线；
如不满足以上两个条件，此次检测结果无效，需重做。
９．８ 结果判定
在满足以上两个质量控制的条件下，根据以下条件进行结果判定：
---Ｃｔ值应显示无扩增曲线或≥４０，且无明显扩增曲线，判断为卡萨诺尔森林病病毒实时荧光
ＲＴ-ＰＣＲ检测阴性；
---Ｃｔ值≤３６，并有明显扩增曲线......