[PDF] SN/T 5105-2019 - 英文版
| 标准号码 | 美元 | 购买PDF | 工期 | 标准名称(英文版) |
| SN/T 5105-2019 | 199 | SN/T 5105-2019 | <=3 | 国境口岸轮状病毒（B组）实时荧光RT-PCR检测方法 |
| 基本信息 | |
|---|---|
| 标准编号 | SN/T 5105-2019 (SN/T5105-2019) |
| 中文名称 | 国境口岸轮状病毒（B组）实时荧光RT-PCR检测方法 |
| 英文名称 | (Real-time fluorescent RT-PCR detection method for border port rotavirus (group B)) |
| 行业 | 商检行业标准 (推荐) |
| 中标分类 | C62 |
| 国际标准分类 | |
| 字数估计 | 9,999 |
| 发布日期 | 2019-09-03 |
| 实施日期 | 2020-03-01 |
| 标准依据 | 海关总署公告2019年第142号 |
| 发布机构 | 海关总署 |
SN/T 5105-2019: 国境口岸轮状病毒（B组）实时荧光RT-PCR检测方法
SN/T 5105-2019 英文名称: (Real-time fluorescent RT-PCR detection method for border port rotavirus (group B))
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
国境口岸轮状病毒（B组）实时荧光
RT-PCR检测方法
中华人民共和国海关总署 发 布
前言
本标准按照GB/T １．１-２００９给出的规则起草。
本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。
本标准起草单位：中华人民共和国拱北海关、中华人民共和国厦门海关、中华人民共和国深圳海关、
深圳市计量质量检测研究院。
本标准主要起草人：莫秋华、杨坤宇、杨泽、汪海波、史蕾、陈晶、陈新彬、吴锦顺、涂承宁、史咏梅、
杨国武。
国境口岸轮状病毒（B组）实时荧光
RT-PCR检测方法
１ 范围
本标准规定了国境口岸成人腹泻轮状病毒（Ｂ组）实时荧光ＲＴ-ＰＣＲ检测的对象、检测方法及结果
报告。
本标准适用于国境口岸成人腹泻轮状病毒（Ｂ组）的实验室检测。
２ 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB １９４８９ 实验室 生物安全通用要求
ＳＮ/T １７２０ 出入境口岸轮状病毒感染监测规程
ＷＳ/T ２３０ 临床诊断中聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术的应用
人间传染的病原微生物名录（原中华人民共和国卫生部）
４ 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
ＤＥＰＣ：焦碳酸乙二酯（ｄｉｅｔｈｙｌｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）
ＰＡＧＥ：聚丙烯酰胺凝胶电泳（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）
ＨＰＬＣ：高效液相色谱（ｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）
ｂｐ：碱基对（ｂａｓｅｐａｉｒ）
ＦＡＭ：６-羧基一荧光素（６-ｃａｒｂｏｘｙ-ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）
ＤＡＢＣＹＬ：４，４-二甲氨基-偶氮苯-４’-羧酸（４，４-ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ-ａｚｏｂｅｎｚｅｎｅ-４′-ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃａｃｉｄ）
５ 检测对象
５．１ 国境口岸发现的有呕吐、腹泻和发热等症状，疑似腹泻病毒感染的急性肠胃炎病人。
５．２ 其他申请检验的人员。
６ 生物安全和PCR防污染要求
实验室生物安全应符合GB １９４８９和《人间传染的病原微生物名录》的规定。ＰＣＲ防污染措施按
ＷＳ/T ２３０的规定执行。
７ 主要仪器
主要仪器设备如下：
---二级Ｂ型生物安全柜；
---台式高速冷冻离心机（最高离心力１２０００×ｇ以上）；
---旋涡振荡器；
---冰箱：４℃、-２０℃和-７０℃；
---超净工作台；
---微型离心机；
---荧光定量ＰＣＲ仪；
---电子天平（ｄ＝１ｍｇ）；
---微波炉；
---电泳仪；
---高压灭菌锅；
---超纯水器或双蒸水器；
---微量可调移液器一套（含以下５种规格：１０μＬ、２０μＬ、１００μＬ、２００μＬ、１ｍＬ）。
８ 主要试剂
８．１ 无ＲＮＡ酶的ＤＥＰＣ水。
８．２ 引物和探针：ＲＴ-ＰＣＲ引物应为ＰＡＧＥ以上级别纯化，探针为 ＨＰＬＣ纯化，引物和探针序列
见９．２．３．１。
８．３ 一步法荧光ＲＴ-ＰＣＲ基础试剂：宝生物工程（大连）有限公司ＯｎｅＳｔｅｐＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐＴＭＲＴ-ＰＣＲＫｉｔ
（ＰｅｒｆｅｃｔＲｅａｌＴｉｍｅ）１）。
１） 给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可和推荐。如果其他等效产品具有相同的
效果，则可使用这些等效产品。
９ 检验程序
９．１ 样品采集
粪便标本和呕吐物标本的采集按照ＳＮ/T １７２０执行。
９．２ 实验室检验
９．２．１ 样品处理
取黄豆大小约１００ｍｇ～２００ｍｇ的粪便标本或呕吐物，或１００μＬ～２００μＬ水样便，加入８００μＬ的生理盐水，剧烈振荡混匀，制成１０％～２０％的悬液：然后４℃，８０００×ｇ离心５ｍｉｎ；转移上清至灭菌的
干净离心管。不能立即进行检测时，样本冻存于-７０℃超低温冰箱备用。
９．２．２ 病毒核酸提取
取处理好的样本１５０μＬ，加入７５０μＬＴｒｉｚｏｌ液，振荡混匀后室温静置５ｍｉｎ，然后加入２００μＬ三氯甲烷，盖紧离心管，振荡混匀１５ｓ后室温静置５ｍｉｎ，４℃，１２０００×ｇ离心１０ｍｉｎ，取上层水相至另一
离心管中，加入等量异丙醇沉淀ＲＮＡ，充分混匀后室温放置１０ｍｉｎ，１２０００×ｇ离心１０ｍｉｎ，弃上清液，
再加入１ｍＬ的７０％乙醇洗涤一次，１２０００×ｇ离心５ｍｉｎ，弃上清液，室温放置２ｍｉｎ～３ｍｉｎ后加入
２０μＬ～５０μＬＤＥＰＣ水（或其它核酸溶解液）溶解核酸沉淀，分装后于-７０℃条件下保存，备用。
９．２．２．２ 试剂盒提取纯化核酸法
按适用于病毒基因组提取的商品试剂盒说明书操作。
９．２．３ 实时荧光RT-PCR检测
９．２．３．１ 引物和探针
引物应用液浓度配制成１０μｍｏｌ／Ｌ。探针应用液浓度配制成５μｍｏｌ／Ｌ，探针的５’和３’端分别用ＦＡＭ和Ｄａｂｃｙｌ标记。
引物和探针的序列见表１。
９．２．３．２ 阳性对照和空白对照设置
检测过程中分别设阳性对照和空白对照。阳性对照为成人腹泻轮状病毒（Ｂ组）阳性样本核酸，或
者为克隆轮状病毒（Ｂ组）的部分核苷酸序列（必须包含扩增区域在内）在体外转录合成的ＲＮＡ，序列见
附录Ａ；空白对照用无菌水。
９．２．３．３ 反应体系组成
一步法实时荧光ＲＴ-ＰＣＲ反应体系采用以下参数：２×ＯｎｅＳｔｅｐＲＴ-ＰＣＲＢｕｆｆｅｒⅢ（含ｄＮＴＰ和
Ｍｇ２＋等）１２．５μＬ；引物ＡＤＲＶ-ＦＰ１．０μＬ；引物ＡＤＲＶ-ＲＰ１．０μＬ；探针ＡＤＲＶ-Ｐ０．５μＬ；ＲｏｘＲｅｆｅｒ-ｅｎｃｅＤｙｅⅡ０．５μＬ；ＴａＫａＲａＥｘＴａｑＨＳ（５Ｕ／μＬ）０．５μＬ；ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴＥｎｚｙｍｅＭｉｘⅡ０．５μＬ；ＲＮＡ模板５．０μＬ；加水补足至２５μＬ。ＲＮＡ 样本在加入前可以在９４℃热处理３ｍｉｎ后再置冰上骤冷５ｍｉｎ。
９．２．３．４ 反应条件
一步法实时荧光ＲＴ-ＰＣＲ反应条件：４２℃反转录５ｍｉｎ；９５℃预变性１０ｓ；９５℃变性５ｓ，５５℃退
火３５ｓ，６８℃延伸１０ｓ，４０个循环；选择ＦＡＭ通道于５５℃退火时收集荧光信号；设置ＲＯＸ通道为参
比通道。不同实验室可根据所使用的试剂和仪器参考上述反应条件作适当调整。
９．２．４ 检验结果判断及报告
在实时荧光 ＲＴ-ＰＣＲ实验中，若阳性对照有明显的荧光增幅现象，且Ｃｔ值在预期的范围之内
（≤３０）；空白对照无荧光增幅现象，则表明反应体系运行正常，可以进行结果判定，否则，试验视为无效，
需重新试验。
当同时进行的阳性对照和空白对照试验结果正常，本方法检验结果判定及报告如下：
---检测样品有明显的荧光增幅曲线，且Ｃｔ值≤３５时，判为阳性，报告“检出成人腹泻轮状病毒（Ｂ
组）特异性基因（实时荧光ＲＴ-ＰＣＲ法）”；
---检测样品荧光增幅曲线的Ｃｔ值介于３５和４０之间时，建议采用浓缩方式处理核酸样本，再重
新进行实时荧光ＲＴ-ＰＣＲ检测。若重新检测的Ｃｔ值仍介于３５......