路径: 主页 > SN/T > 第62页 > SN/T 5192-2020 | 标准编号 | SN/T 5192-2020 (SN/T5192-2020) | | 中文名称 | 嗜皮菌病检疫技术规范 | | 英文名称 | (Technical specifications for dermatophilia quarantine) | | 行业 | 商检行业标准 (推荐) | | 中标分类 | B41 | | 国际标准分类 | 65.020.30 | | 字数估计 | 14,192 | | 发布日期 | 2020-12-30 | | 实施日期 | 2021-07-01 | | 标准依据 | 海关总署公告2020年第136号 | | 发布机构 | 海关总署 | SN/T 5192-2020: 嗜皮菌病检疫技术规范
SN/T 5192-2020 英文名称: (Technical specifications for dermatophilia quarantine)
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
代替 SN/T 1162-2002
嗜皮菌病检疫技术规范
中华人民共和国海关总署 发 布
前言
本文件按照 GB/T 1.1-2020 的规定起草。
本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。
本文件起草单位：中华人民共和国青岛海关、中华人民共和国长沙海关。
本文件主要起草人：朱来华、朱可、唐连飞、张金玲、郑小龙、王群、孙涛、邓明俊、张晓文、
姜帆、王宫璞、辛学谦。
嗜皮菌病检疫技术规范
1 范围
本文件规定了嗜皮菌病的临床诊断、病原分离鉴定、分子生物学鉴定技术和血清学试验等检疫
技术。
本文件适用于动物嗜皮菌病的检疫和诊断。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文
件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适
用于本文件。
GB/T 14926.43 实验动物 细菌学检测 染色法、培养基和试剂
GB 19489 实验室 生物安全通用要求
4 生物安全措施
试验环境和防护要求见 GB 19489。
5 临床诊断
5.1 器材及消毒药物
5.1.1 器材
工作服、乳胶手套、线手套、防护面具、口罩、风镜、反光镜、手电筒、煮沸消毒器、脸盆、
耳夹子。
5.1.2 消毒药物
0.1% 升汞水、2.5% 来苏尔、0.1% 新洁尔灭或 75% 酒精棉球等。
5.2 检查方法
5.2.1 检查者及助手均应穿工作服，戴好乳胶手套、口罩、风镜及防护面具，选择适当位置，对保定
好的动物进行检查。
5.2.2 检查头部（尤其是唇部）、颈部、背部、胸腹部、四肢、会阴部、尾部是否出现浅表渗出性、局
限性的角质皮疹或硬痂。
5.2.3 检查结束，脱掉手套，检查者及助手的手需用 0.1% 升汞水或 2.5% 来苏尔或 0.1% 新洁尔灭或
75% 酒精棉球彻底消毒，工作服及用过的器材分别用 2.5% 来苏尔等浸泡 1 h，或煮沸 10 min 消毒。检
疫现场用 10% 石灰乳、2% 热火碱水或 10%～20% 漂白粉水溶液消毒。
5.3 临床特征
出现特征性临床症状，如体表皮肤或黏膜出现渗出性皮炎、皮疹或硬痂，即可初步判定。
5.4 判定
根据临床特征（见 5.3）可做出初步诊断。进一步确诊应采集病料或血清样品进行实验室检查。
6 病原分离与鉴定
6.1 材料准备
6.1.1 器材
组织捣碎机、恒温水浴箱、恒温生化培养箱、普通冰箱及低温冰箱（4 ℃、-20 ℃）、离心机及离
心管、普通生物显微镜、荧光显微镜、擦镜纸、手术刀、镊子、微量移液器、胶头滴管、载玻片、盖
玻片、接种环、酒精灯。
6.1.2 培养基与试剂
甲醛、多粘菌素 B、PBS（0.1 mol/L pH7.2），见附录Ａ。
绵羊鲜血琼脂培养基（平板）或血清肉汤培养基（试管）、革兰氏染色液、姬姆萨染色液，按
GB/T 14926.43 规定配制。
6.2 样品采集和运送
6.2.1 样品采集
从病变部位无菌采集痂皮和痂皮下渗出液等病料。
6.2.2 样品运送
在低温条件（2 ℃～8 ℃）下，样品尽快（24 h～48 h 内）送往实验室。
6.3 病料涂片或压片镜检
新剥离的新鲜、湿润痂皮可直接在载玻片上压印而制成压片；硬变痂皮或风干痂皮在 PBS 中浸
泡过夜使其充分湿润，然后将其紧压在载玻片上压印而制成压片。痂皮下渗出液，用接种环勾取在载
玻片上涂布而制成涂片。
6.4 病原分离培养
取制备好的绵羊鲜血琼脂培养基（平板）或血清肉汤培养基（试管），无菌操作将采集的样品用
接种环勾取痂皮下渗出液，或切取小块痂皮（1 cm×1 cm），用 PBS 反复冲洗 5 次后，用组织捣碎机
乳化制成 10% 悬液，接种于培养基，每个样品接种 2 个平板或试管。如悬液经 0.45 µm 滤膜过滤，
可充分减少或消除污染，或在培养基中加入 1 000 U/mL 多粘菌素 B 以抑制污染菌生长。
将接种好的平板或试管置 37 ℃恒温培养，最初 24 h 应检查是否有杂菌污染。24 h 后就每天观察，
培养 4 d～7 d。
6.5 病原鉴定
6.5.1 菌落鉴定
观察培养基上有无疑似特征性菌落。肉汤培养基形成菌膜。在平板上培养 24 h～48 h 后，在培养
基上形成有溶血的、黄灰色的、粗糙型菌落（直径大约 1 mm）。72 h 后常出现淡黄色光滑型菌落。粗
糙型菌落是由分枝菌丝形成的，光滑型菌落是由球状菌形成的。
6.5.2 革兰氏染色鉴定
6.5.2.1 革兰氏染色鉴定按 GB/T 14926.43 规定操作。
6.5.2.2 结果判定：本菌为革兰氏阳性菌，呈紫色。镜检寻找分枝及多隔的菌丝或平行排列的革兰阳
性球菌样细胞丛。
6.5.3 姬姆萨染色鉴定
6.5.3.1 姬姆萨染色鉴定按 GB/T 14926.43 规定操作。
6.5.3.2 结果判定：菌体呈分隔的分枝状长菌丝，并横向分裂成多排球杆菌或卵圆状球菌，刚果
嗜皮菌染色较深，因此深染的刚果嗜皮菌与角质细胞或嗜中性细胞的浅色或粉色复染背景形成反
差，更容易区分厚涂片中的刚果嗜皮菌。对疑似菌需要进行下一步的 PCR 检测或者免疫荧光检查
进行确诊。
6.5.4 生理生化鉴定
6.5.4.1 生理生化鉴定按 GB/T 14926.43 规定操作。
6.5.4.2 生理生化鉴定结果，见附录 B。
7 分子生物学鉴定技术
7.1 材料与试剂
7.1.1 仪器与器材
PCR 检测仪，高速台式冷冻离心机（离心速度 12 000 r/min 以上），台式离心机（离心速度 2 000 r/min），
混匀器，冰箱（2 ℃～8 ℃和-20 ℃两种），微量可调移液器（10 µL、100 µL、1 000 µL）及配套带滤
芯吸头，eppendorf 离心管（1.5 mL 带盖塑料离心管），稳压、稳流电泳仪和水平电泳槽，电泳凝胶成
像系统（或紫外分析仪）。
7.1.2 引物
加灭菌蒸馏水配制成 20 µmol/L 工作液。PCR 引物序列见表 1。
7.1.3 试剂
除特别说明以外，本文件所用试剂均为分析纯。
蛋白酶 K、10%SDS 液、苯酚、三氯甲烷、异丙醇（-20℃预冷）、3 mol/L 的 NaAc、75% 乙醇、
Taq 酶（5 U/µL）、10×PCR 缓冲液、dNTPs（含有 dATP、dTTP、dCTP、dGTP 各 10 mmol/L）、电泳
缓冲液（0.5×TBE 缓冲液）、EB、电泳加样缓冲液、0.1 mol/L PBS（pH 8.0），见附录 C。
7.2 DNA 模板的制备
7.2.1 取 n 个灭菌的 1.5 mL 离心管，其中 n 为被检样品、阳性对照与阴性对照的和（阳性对照、阴性
对照在试剂盒中已标出），编号。
7.2.2 每管加 pH 7.0 PBS 1 mL，从分离培养后的培养基挑取单个疑似特征性菌落，混匀于 PBS 中，于
4 ℃ 15 000 r/min 离心 1 min，去上清液。
7.2.3 沉淀重悬于 50 µL 蒸馏水，煮沸 10 min，于 4 °C 15 000 r/min 离心 3 min，去沉淀，上清液转移至
新离心管中。
7.2.4 每管加入蛋白酶 K 至终浓度 100 µg/mL 和 SDS 至终浓度 10 mg/mL，55 ℃水浴 2 h。
7.2.5 每管分别加入苯酚、苯酚∶三氯甲烷∶异戊醇混合液（体积比为 25∶24∶1）、三氯甲烷各抽提
1 次，吸取水相转移至新离心管中。
7.2.6 每管加入 1/10 体积 3 mol/L 的乙酸钠和 2.5 倍体积的无水乙醇，轻轻混匀后置-20 ℃沉淀 1 h,
4 ℃条件下 12 000 r/min 离心 15 min，弃掉上清液。
7.2.7 每管加入 75% 乙醇洗涤，4 ℃条件下 12 000 r/min 离心 5 min，沉淀烘干后悬浮于灭菌的 20 µL 超
纯水中，取适量用作 PCR 模板。若需长期保存应放置 -70 ℃冰箱中。
7.3 PCR 反应
7.4 对照设立
从 DNA 抽提开始，设立阳性对照、阴性对照。以含有已知刚果嗜皮菌 NCTC 11184 株（美国
ATCC）的细菌悬液作为阳性对照，蒸馏水作为阴性对照。
7.5 PCR 产物琼脂糖电泳
用 TBE 电泳缓冲液配制 1％的琼脂糖（含 0.5 µg/mL EB）平板。将平板放入水平电泳槽，使电泳
缓冲液刚好淹没胶面。将 8 µL 样品和 2 µL 样品缓冲液混匀后加入样品孔。在电泳时设立 DNA 标准
分子量作对照。5 V/cm 电泳约 30 min，当溴酚蓝到达底部时停止。在紫外灯下观察结果。
7.6 结果判定
阳性对照会出现一条 500 bp 的 DNA 片段，而阴性对照没有该核酸带，则试验成立。如果样品出
现 500 bp 的 DNA 片段，则判为阳性，其他情况判为阴性。
出现阳性扩增片段时，需要对扩增产物进行序列测定。
8 血清学鉴定技术
8.1 荧光抗体试验
8.1.1 试验器材
恒温培养箱、荧光显微镜、载玻片、盖玻片、玻璃铅笔、接种环、镊子、染色缸。
8.1.2 试验试剂
PBS-T（0.1 mol/L pH7.2）、甘油缓冲液、丙酮∶乙醇（按体积比 1∶1 混匀，-20 ℃预冷）、生理
盐水
标准抗原、标准阳性血清、标准阴性血清、异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗抗体等由国家指
定单位提供，按说明书使用。
8.1.3 操作程序
8.1.3.1 制备抗原玻片，用玻璃铅笔在载玻片上画定区域（直径 0.5 cm），病料按 5.2 和 5.3 直接涂片或
压片，或用接种环在琼脂培养基上钩取单个菌落，涂布均匀，制成薄涂片，风干。
8.1.3.2 滴加预冷丙酮∶乙醇，固定细胞 5 min～10 min ；用 PBS-T 洗涤 3 次，每次 5 min，甩干。
8.1.3.3 加 100 µL 封闭液，使之布满整个标本，在 37 ℃孵育 30 min，甩干；用 PBS-T 洗涤 3 次，每次
5 min，甩干。
8.1.3.4 加标准血清 50 µL，置湿盒中 4 ℃孵育过夜；PBS-T 洗涤 3 次，每次 5 min，甩干。
8.1.3.5 加入工作浓度的异硫氰酸荧光素（FITC）标记抗抗体，使之布满整个标本，在 37 ℃湿盒中孵
育 30 min ；PBS-T 洗涤 3 次，每次 5 min，甩干。
8.1.3.6 在标本处滴一小滴缓冲甘油液，轻轻加上盖玻片，用荧光显微镜检查。
8.1.3.7 将载玻片放在荧光显微镜载物台上，调好光源进行观察。
8.1.3.8 结果判定：将载玻片放在荧光显微镜载物台上，调好光源即可观察。阳性反应者 FITC 荧光色
素呈明亮的黄绿色荧光。阴性反应则没有相应的荧光出现。
8.2 酶联免疫吸附试验
8.2.1 器材
96 孔酶标板、可调移液器、恒温培养箱、电子天平、酶标仪。
8.2.2 试剂
包被缓冲液、洗涤缓冲液（PBS-T）、稀释液、底物缓冲液（使用前配制）、终止液。
标准抗原、标准阴性血清、标准阳性血清、辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗抗体等由国家指定
单位提供，按说明书使用。
8.2.3 操作方法
8.2.3.1 用纯化培养的细菌培养物，稀释成 1∶100 悬液，每孔加 l00 µL 包被酶标板，放置 4 ℃过夜孵育。
8.2.3.2 用 PBS-T 洗涤酶标板 3 次，每次 5 min。
8.2.3.3 每孔加入 100 µL 封闭液，于 23 ℃～25 ℃轻轻振荡，在湿盒中孵育 30 min。
8.2.3.4 用 PBS-T 洗板 3 次，每次 5 min。
8.2.3.5 将待检血清（见附录 D）用稀释液 1∶40 稀释，加入 100 µL，将酶标板置湿盒中 37 ℃振荡孵
育 1 h。每个血清稀释度做 2 个平行对照，同时设阳性血清对照和阴性血清对照。
8.2.3.6 用 ......
|