[PDF] SN/T 5224-2019 - 英文版
| 标准号码 | 美元 | 购买PDF | 工期 | 标准名称(英文版) |
| SN/T 5224-2019 | 229 | SN/T 5224-2019 | <=3 | 出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检验方法 实时荧光PCR内标法 |
| 基本信息 | |
|---|---|
| 标准编号 | SN/T 5224-2019 (SN/T5224-2019) |
| 中文名称 | 出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检验方法 实时荧光PCR内标法 |
| 英文名称 | (Test method for Listeria monocytogenes in exported foods Real-time fluorescent PCR internal standard method) |
| 行业 | 商检行业标准 (推荐) |
| 中标分类 | C53 |
| 国际标准分类 | 67.050 |
| 字数估计 | 10,173 |
| 发布日期 | 2019 |
| 实施日期 | 2020-07-01 |
| 发布机构 | 海关总署 |
SN/T 5224-2019
Detection of Listeria monocytogenes in food for export-Real-time PCR with
internal amplification control method
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
2019-12-27 发布
2020-07-01 实施
中华人民共和国海关总署 发 布
前言
本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。
本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。
本标准起草单位：中华人民共和国杭州海关、上海交通大学、中国检验检疫科学研究院。
本标准主要起草人：李可、施春雷、王娉、史贤明、方莹、张晓峰、崔妍。
出口食品中单核细胞增生李斯特菌检验方法
实时荧光 PCR 内标法
1 范围
本标准规定了出口食品中单核细胞增生李斯特菌的实时荧光 PCR 内标方法。
本标准适用于出口食品中单核细胞增生李斯特菌的快速检测。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB 4789.30-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489 实验室 生物安全通用要求
GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测
3 定义、术语和缩略语
下列定义、术语和缩略语适用于本文件。
3.1 定义和术语
下列术语和定义适用于本文件。
3.1.1 扩增内标 internal amplification control，IAC
添加到 PCR 反应体系中用以指示假阴性现象的一段人工构建 DNA 序列或者是一段致病菌的看家基
因序列。主要原理是：在荧光定量 PCR 中使用与目的基因相似的扩增内标，它的两端引物结合序列与
目的基因完全一致，但具有不同的探针结合序列，使之不能与目的基因的探针结合，只能与内标探针
结合。将扩增内标添加到 PCR 反应体系中，使之与目标基因序列共同进行扩增，如果在反应体系中存
在一些抑制因素，则扩增内标和目标序列的扩增都将受到抑制，从而达到指示 PCR 反应假阴性的目的。
3.1.2 Ct 值 cycle threshold Ct
每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。
3.2 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
4 方法提要
荧光 PCR 反应体系中，预先加入能同时扩增目标片段和扩增内标的引物，以及目标菌探针、内
标检测探针以及内标质粒，然后将样品 DNA 加入 PCR 反应液中进行两步法荧光 PCR 反应，在扩增
内标质粒与样品 DNA 的共同扩增中如果存在抑制现象，扩增内标的 PCR 扩增也将被抑制，从而达到
对样品的荧光 PCR 检测过程进行假阴性监控目的。
5 试剂
除另有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯，实验用水符合 GB/T 6682 中一级水的要求。
所有试剂均用无 DNA 酶污染的容器分装。
5.1 DNA 提取试剂：DNA 提取液：20 mmol/L Tris-HCl， 2 mmol/L EDTA，1.2% Triton X-100（pH
8.0），也可使用商业化的 DNA 提取试剂。
5.2 Taq DNA 聚合酶。
5.3 dNTP 混合液。
5.4 10×PCR 缓冲液：200 mmol/L Tris-HCl（pH 8.4），200mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2。
5.5 引物和探针：见附录 A。
5.6 内标质粒：参见附录 B。
6 主要仪器和设备
6.1 恒温水浴锅或加热套装置：100℃。
6.2 恒温培养箱：36℃ ±1℃，30℃ ±1℃。
6.3 离心机：最大转速 13 000 r/min 以上。
6.4 天平：感量 0.1 g。
6.5 冰箱：-20℃ ~4℃。
6.6 均质器。
6.7 可调移液器：1 µL-1000 µL。
6.8 荧光 PCR 仪。
7 检验程序
食品中单核细胞增生李斯特菌的扩增内标荧光 PCR 检测流程见图 1。
图 1 食品中单核细胞增生李斯特菌检验程序
8 操作步骤
8.1 样品制备、增菌培养
按照 GB 4789.30-2016 中第一法进行样品制备和增菌（两次增菌）。
8.2 细菌模板 DNA 的制备
取 8.1 中培养的二次增菌液 1 mL，加到 1.5 mL 无菌离心管中，8 000 r/min 离心 5 min，吸弃上
清液；加入 50 μL DNA 提取液（使用前室温解冻并充分混匀，快速吸取），混匀后沸水浴 10 min，置
冰上 10 min ；12000 r/min 离心 5 min，取上清保存于-20℃备用以待检测。
也可采用等效的商品化 DNA 提取试剂盒并按其说明制备模板 DNA。
8.3 荧光 PCR 检测
8.3.1 荧光 PCR 反应体系
荧光 PCR 反应所用引物和探针见附录 A，PCR 反应体系见表 1。也可采用商品化的 PCR 扩增体系。
每个 DNA 样品做 2 个平行管。加样时应使样品 DNA 溶液完全落入反应液中，不要粘附于壁上，加样
后尽快盖紧管盖。
8.3.2 阳性对照、阴性对照和空白对照设置
检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照采用含有检测序列的 DNA（或质粒）
和 IAC 片段同时作为荧光 PCR 反应的模板，阴性对照采用含 IAC 片段的质粒作为荧光 PCR 反应的模
板，空白对照用无菌水作为荧光 PCR 反应的模板。
8.3.3 荧光 PCR 反应程序
荧光 PCR 反应循环参数为 95℃ 4 min ； 95℃ 5 s，65℃ 20 s，45 个循环。信号采集设为 FAM、
HEX 荧光素（FAM 荧光素代表样品中单核细胞增生李斯特菌信号，HEX 荧光素代表扩增内标信号）。
注：因不同 PCR 仪的性能差异，可通过条件优化适当调整 PCR 循环的退火温度及时间。
9 荧光阈值的确定
PCR 反应完成后应设定荧光阈值以分析样品的 Ct 值，以 PCR 反应的前 3 个 ~15 个循环的荧光信
号作为基线信号（噪音），荧光阈值理论上定义为基线信号的标准偏差的 10 倍，在实际应用中可以根
据仪器基线信号进行人工调整，设定原则是以阈值线刚好超过正常阴性对照样品扩增曲线（无规则的
噪音线）的最高点，且不出现 Ct 值为准。
10 结果及判断
10.1 质控标准
质控标准如下：
--空白对照：FAM 荧光素和 HEX 荧光素均无扩增曲线，Ct ≥ 40.0 ；
--阴性对照：FAM 荧光素无扩增曲线，Ct ≥ 40.0 ；HEX 荧光素出现典型的扩增曲线，Ct 值应
< 35.0 ；
--阳性对照：FAM 荧光素出现典型的扩增曲线，Ct 值应 < 35.0 ；
否则，实验视为无效。
10.2 结果判断
按如下内容进行结果判断：
-- Ct 值（FAM）≥ 40.0，可判定样品结果为阴性，可直接报告未检出相应致病菌；
-- Ct 值（FAM）≤ 35.0，可判定该样品结果为阳性；
-- Ct 值（FAM） >35.0，而 < 40，建议样本重做，再次扩增后的结果 Ct 值如果仍小于 40，并有
典型的扩增曲线，且对照结果均正常，则可判定该基因为阳性。
对于阳性结果，应对样品的二次增菌液或可疑纯菌落进一步按 GB 4789.30 中第一法操作步骤进
行确认后报告结果。
11 生物安全和防污染措施
11.1 生物安全措施
为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员进行操作，所有培养物和废弃物应参照
GB 19489 中的有关规定。
11.2 防污染措施
防污染措施应符合 GB/T 27403 的规定。
附 录 A
（规范性附录）
荧光 PCR 所用引物和探针
A.1 单核细胞增生李斯特菌检测所用引物、探针和内标序列检测探针见表 A.1，单核细胞增生李
斯特菌探针 5' 端为 FAM 标记，3' 端为 ECLIPCE 标记，内标序列探针 5' 端为 HEX 标记，3' 端为
ECLIPCE 标记。
B.3 感受态细胞的制备
B.3.1 以无菌接种环取保存的 E.coli TG1 菌株于 LB 琼脂平板划线，37℃培养。
B.3.2 挑取 LB 琼脂平板上的大肠杆菌 TG1 单菌落，接入 5 mL LB 液体培养基中，37℃摇床培养 12 h。
B.3.3 按 1% 接种量将大肠杆菌过夜培养物转接入 50 mL LB 中，37℃摇床培养至 OD600 值约为 0.6，
置于冰中冷却 10 min。
B.3.4 在 4℃，6000 r/min 条件下离心 5 min，倒去上清液，将细胞重悬于预冷的 10 mL 0.1M CaCl2 中，
在冰上放置 20 min 以上。
B.3.5 在 4℃，6000 r/min 条件下离心 5 min，去上清，细胞重新悬浮于 2 mL 预冷的含有 15% 甘油
的 0.1 M CaCl2 中，分装成 100 μL 的小份，于- 70℃保存或直接用于转化。
B.4 连接产物的转化
制备抗性平皿，在装有约 100 μL 感受态细胞的 1.5 mL 离心管中加入连接产物 10 μL，轻轻混匀
于冰上放置 30 min 后，42℃水浴中热击 90 s，热击后迅速置于冰上冷却 2 min。向管中加入 400 μL LB
液。体培养基（不含 Amp），37℃ 200 r/min -220 r/min 振荡培养 1 h, 取 100 μL 菌液涂布合适的抗性
平板，37℃培养 1......