[PDF] SN/T 5227.6-2019 - 英文版
| 标准号码 | 美元 | 购买PDF | 工期 | 标准名称(英文版) |
| SN/T 5227.6-2019 | 209 | SN/T 5227.6-2019 | <=3 | 出口食品中水牛源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA法) |
| 基本信息 | |
|---|---|
| 标准编号 | SN/T 5227.6-2019 (SN/T5227.6-2019) |
| 中文名称 | 出口食品中水牛源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA法) |
| 英文名称 | (Rapid detection of buffalo-derived components in exported foods Recombinase-mediated strand replacement nucleic acid amplification method (RAA method)) |
| 行业 | 商检行业标准 (推荐) |
| 中标分类 | C53 |
| 国际标准分类 | 67.050 |
| 字数估计 | 9,982 |
| 发布日期 | 2019 |
| 实施日期 | 2020-07-01 |
| 发布机构 | 海关总署 |
SN/T 5227.6-2019: 出口食品中水牛源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA法)
SN/T 5227.6-2019 英文名称: (Rapid detection of buffalo-derived components in exported foods Recombinase-mediated strand replacement nucleic acid amplification method (RAA method))
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
出口食品中水牛源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）
中华人民共和国海关总署 发 布
前言
SN/T 5227-2019《出口食品中动物源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA
法）》预计分为如下部分：
--第 1 部分：出口食品中鸡源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；
--第 2 部分：出口食品中猪源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；
--第 3 部分：出口食品中羊源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；
--第 4 部分：出口食品中鸭源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；
--第 5 部分：出口食品中牛源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；
--第 6 部分：出口食品中水牛源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；
--第 7 部分：出口食品中马源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；
--第 8 部分：出口食品中驴源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；
--第 9 部分：出口食品中狐狸源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；
--第 10 部分：出口食品中貂源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；
--第 11 部分：出口食品中大鼠源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）。
本部分为 SN/T 5227-2019 的第 6 部分。
本部分按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。
本部分由中华人民共和国海关总署提出并归口。
本部分起草单位：中华人民共和国郑州海关、中华人民共和国杭州海关、解放军疾病预防控制
中心、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国北京海关、中华人民共和国大连海关、中华人民共
和国厦门海关、中华人民共和国石家庄海关、中华人民共和国拱北海关。
本部分主要起草人：苗丽、吴姗、张守杰、张灿、张璐、张九凯、汪琳、郑秋月、徐淑菲、王
建昌、罗宝正、孔繁德。
出口食品中水牛源性成分快速检测
重组酶介导链置换核酸扩增法（RAA 法）
1 范围
SN/T 5227-2019 的本部分规定了出口食品中水牛源性成分的 RAA 检测方法。
本部分适用于出口食品中水牛源性成分的定性检测。
2 规范性引用文件
本部分所规定方法的最低检出限（LOD）为 0.1%（W/W）。
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本
文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 27403-2008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测
3 术语、定义和缩略语
3.1 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
4 方法提要
以提取的 DNA 为模板，采用水牛的特异性检测引物和探针进行实时荧光 RAA 扩增，根据实时荧
光 RAA 的增幅情况，实现对食品和饲料中水牛成分的检测鉴定。
5 试剂和材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合 GB/T 6682 的要求。所有试剂均
用无 DNA 酶污染的容器分装。
5.1 CTAB 提 取 缓 冲 液（pH8.0）：10 g/L CTAB，0.7 mol/L NaCl，0.05 mol/L Tris-HCl，0.01 mol/L
Na2EDTA。
5.2 酚 ： 氯仿 ： 异戊醇 =25 ： 24 ： 1。
5.3 异丙醇。
5.4 70% 乙醇（体积比）。
5.5 TE 缓冲液（pH8.0）：10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1 mmol/L EDTA（pH8.0）。
5.6 缓冲液 A ：20% 聚乙二醇。
5.7 实时荧光 RAA 扩增体系：2.5 mmol/L dNTPs，225 ng/µL SSB，300 ng/µL recA 重组酶蛋白（SC-
recA/BS-recA），75 ng/µL Bsu DNA 聚合酶，75 ng/µL Exo 核酸外切酶，250 mmol/L Tricine，12.5 mmol/
L 二硫苏糖醇，250 ng/µL 肌酸激酶。也可以使用等效的商品化的试剂盒代替。
5.8 缓冲液 B ：280 mol/L 醋酸镁。
6 仪器设备
6.1 实时荧光 PCR 仪。
6.2 恒温荧光检测仪。
6.3 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。
6.4 恒温水浴锅。
6.5 离心机：转速大于等于 12 000 r/min。
6.6 微量移液器：量程 0.5 µL~10 µL，10 µL~100 µL，20 µL~200 µL，200 µL~1 000 µL。
6.7 研钵及粉碎装置。
6.8 涡旋振荡器。
6.9 离心管：2 mL、1.5 mL。
7 检测步骤
7.1 DNA 提取
取 0.2 g 粉碎或磨碎的样品至一洁净的 1.5 mL 离心管（6.9）中（若样品含杂质和调味品，可加入
1 mLdd H2O 洗涤两次），加入 600 µL CTAB 提取缓冲液（pH8.0）（5.1），涡旋振荡混匀后于 70 ℃温
育 15 min，期间颠倒离心管 2~3 次； 12 000 r/min 离心 5 min，取上清液于一新的干净 1.5 mL 离心管中；
加入 500 µL 酚 ： 氯仿 ： 异戊醇（25 ： 24 ： 1）（5.2），上下颠倒离心管 2~3 次后涡旋振荡混匀，12 000 r/min
离心 5 min；转移上层水相至一新的 1.5 mL 离心管中，加入 0.7 倍体积异丙醇，上下颠倒离心管 2~3 次，
4 ℃静置 30 min，4 ℃下 12 000 r/min 离心 3 min，小心弃去上清液；加入 700 µL 70 % 乙醇（5.4），
重悬沉淀，12 000 r/min 离心 1 min，小心弃去上清液；打开管盖，室温挥发干液体，加入 50 µL~100 µL TE
缓冲液（pH8.0）（5.5）溶解 DNA，-20 ℃保存备用。
DNA 提取也可采用等效 DNA 提取试剂盒进行。
7.2 DNA 浓度和纯度的测定
使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测 260 nm 和 280 nm 处的吸光值 A260 和 A280。DNA
的浓度按照式（1）计算：
7.3 实时荧光 RAA 扩增
7.3.1 实时荧光 RAA 反应总体系
7.3.2 实时荧光 RAA 反应程序
7.3.2.1 实时荧光 PCR 仪
39 ℃，60 s，1 个循环；39 ℃，30 s，40 个循环，在每次循环时收集荧光。
7.3.2.2 恒温荧光检测仪
39 ℃，1 min ；39 ℃，20 min，第二阶段开始收集荧光。
7.3.3 实验对照
检测过程中分别设阳性对照、阴性对照、空白对照。采用含有水牛源成分的样品作为阳性对照样
品，不含水牛源成分的样品作为阴性对照样品，以与模板等体积的双蒸水作为空白对照样品。
8 质量控制
8.1 实时荧光 PCR 仪
8.1.1 空白对照：无荧光对数增长，相应的无报告 Ct 值。
8.1.2 阴性对照：无荧光对数增长，相应的无报告 Ct 值。
8.1.3 阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的 Ct 值小于等于 30.0。
8.2 恒温荧光检测仪
8.2.1 空白对照：无荧光对数增长，相应的无报告 T 值（时间）。
8.2.2 阴性对照：无荧光对数增长，相应的无报告 T 值（时间）。
8.2.3 阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的 T 值（时间）小于等于 15 min。
9 结果判断与表述
9.1 结果判定
9.1.1 实时荧光 PCR 仪
9.1.1.1 在符合条款 8.1 的情况下，结果才能判为有效。
9.1.1.2 如 Ct 值小于等于 35.0，则判定被检样品阳性。
9.1.1.3 如大于 35.0 小于 40.0，则重复一次。如再次检测结果仍然是大于 35.0 小于 4......