路径: 主页 > YY/T > 第4页 > YY/T 1561-2017 | 标准编号 | YY/T 1561-2017 (YY/T1561-2017) | | 中文名称 | 组织工程医疗器械产品动物源性支架材料残留α-Gal抗原检测 | | 英文名称 | Tissue engineering medical device products - Remnant α-Gal antigen determination in scaffold materials utilizing animal tissues and their derivative | | 行业 | 医药行业标准 (推荐) | | 中标分类 | C45 | | 国际标准分类 | 11.040.40 | | 字数估计 | 10,156 | | 发布日期 | 2017-03-28 | | 实施日期 | 2018-04-01 | | 发布机构 | 国家食品药品监督管理总局 | YY/T 1561-2017: 组织工程医疗器械产品动物源性支架材料残留α-Gal抗原检测
YY/T 1561-2017 英文名称: Tissue engineering medical device products - Remnant α-Gal antigen determination in scaffold materials utilizing animal tissues and their derivatives
ICS 11.040.40
C45
中华人民共和国医药行业标准
组织工程医疗器械产品
动物源性支架材料残留α-Gal抗原检测
国家食品药品监督管理总局 发 布
1 范围
本标准给出了组织工程医疗器械产品支架材料制备时使用的动物源性生物材料中残留α-Gal抗原
的定量检测方法。
本标准适用于制备组织工程医疗器械产品支架材料的各种动物来源的生物材料或其衍生物的
α-Gal抗原检测。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 16886.20 医疗器械生物学评价 第20部分:医疗器械免疫毒理学试验原则与方法
(GB/T 16886.20-2015,ISO/T S10993-20:2006,IDT)
YY/T 0606.25 组织工程医疗产品 第25部分:动物源性生物材料DNA残留量测定法:荧光染
色法
3 术语和定义
GB/T 16886.20和YY/T 0606.25界定的术语和定义适用于本文件。
4 试剂和仪器
4.1 试剂
试剂包括:
b) 碳酸盐缓冲液(pH9.5);
c) 市售α-GalEpitope(Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-R),mAb(M86),分装后-20℃保存;
d) 市售Galα1-3gal-BSA(3atomspacer,简称Gal-BSA),溶于去离子水中,分装后-20℃保存
备用;
e) 辣根酶标记的山羊抗小鼠二抗(IgM-HRP);
g) 血清白蛋白;
h) 裂解液(市售品),其主要组成成分包括:50mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris,pH7.4),
150mmol/L氯化钠(NaCl),1% (体积分数)聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100),1%(质量
i) 洗液:0.05%(体积分数)的吐温-20/PBS;
j) 10%(体积分数)H2SO4;
k) Gal抗原阳性生物材料参考品;
l) Gal抗原阴性生物材料参考品。
4.2 仪器
仪器包括:
a) 37℃恒温摇床;
b) 酶标仪;
c) 冷冻离心机;
d) 震荡器;
e) 高精度天平(0.0001g);
f) 匀浆仪;
g) 移液枪;
h) pH计。
5 试验步骤
5.1 样品准备
5.1.1 试验样品
精确称取试验样品(2mg~10mg),置于2.0mL或5mL无菌离心管内;若为固态块状或片状试
验样品,则用无菌眼科剪将样品剪裁成细小碎块,液态或粉末状试验样品无需特殊处理;加入裂解液(可
使用市售品)配制成样品浓度为2mg/mL~10mg/mL[使用前加入1%(体积分数)1mmol/LPMSF,
为操作方便推荐至少每份样品配制2mL的裂解液],低温匀浆2min~10min,至样品全部粉碎,形成
均匀组织匀浆;室温(25℃±5℃)放置30min~3h至样品全部裂解(肉眼观察无明显固态物质存在),
离心(3000r/min~5000r/min)取上清备用。
注1:每份样品设平行样3份,最终测定结果取其平均值±SD。
注2:可以根据委托方的要求,取不同批号或同一批号的样品3份,用以评价不同批次或同一批次内的工艺稳定性。
5.1.2 标准曲线样品
精确称取Gal抗原阴性生物材料参考品(冻干粉)样品2mg,置于2mL或5mL无菌离心管内,加
入裂解液[使用前加入1%(体积分数)1mmol/LPMSF]配制成样品浓度为2mg/mL,含Galα1-3gal-
BSA;室温(25℃±5℃)放置30min~3h至样品全部裂解,进行离心(3000r/min~5000r/min)后取
上清液,用裂解液进行倍比梯度浓度稀释,得到最少不低于5个Galα1-3gal-BSA系列稀释浓度的稀释
液,用于做标准曲线。为得到每次试验的最低检测限,应稀释到检测OD值与Gal抗原阴性参考品检测
OD值相等或相近的浓度,从而确定其上一个浓度为本次试验的最低检测限。
注:宜根据待测样品Gal抗原含量的高低,通过预实验确定 Galα1-3gal-BSA的浓度范围,保证待测样品的检测
OD值在标准曲线范围内。
5.1.3 Gal抗原阳性和Gal抗原阴性参考品样品
分别精确称取2mgGal抗原阳性和阴性参考品(冻干粉),放于2mL或5mL无菌离心管内,加入
裂解液配制成2mg/mL[使用前加入1%(体积分数)1mmol/LPMSF],室温(25℃±5℃)放置
30min~3h至样品全部裂解;将裂解后样品进行离心后取上清液备用。
5.1.4 对照孔样品
设定 M86/Gal抗原阴性生物材料参考品裂解液反应样品1份作为100%的反应值;裂解液反应样
品1份作为背景值。
5.2 M86抗体孵育
5.1中每个样品分别取200μL置于1mL离心管中,标记,每管分别加入等体积(200μL)稀释比例
为1∶100~1∶200的 M86抗体溶液(应保证 M86抗体是过量的,可通过预实验确认)。混匀后在室温
(25℃+5℃)温和摇动(如:100r/min)条件下反应2h,之后置于4℃孵育过夜。次日,在离心速度为
14000g,4℃条件下离心30min后取上清液备用。
注:因 M86是一种非纯化的抗体,不同批次之间的活性可能存在差异。建议在新试剂使用前先确认抗体活性与既
往使用批次是否有差异,必要时重新验证抗体稀释比例的合理性。
5.3 ELISA抑制法检测上清液中剩余 M86抗体
5.3.1 固相抗原包被板的制备
首先用去离子水将Galα1-3gal-BSA(如:500μg/mLGal-BSA)稀释一定倍数(如:25倍),再用
pH9.5的碳酸盐缓冲液再次稀释(如:10倍),制备2μg/mLGalα1-3gal-BSA稀释溶液。取100μL/孔,
加入酶标板,混匀后在室温温和摇动2h,之后置于4℃孵育过夜进行包被。次日用洗液(0.05%的吐
温-20/PBS)洗板至少3次(伴随温和摇动,100r/min),在吸水纸上拍干。加入1%(质量浓度)的血清
白蛋白200μL/孔进行封闭,置于37℃,2h,伴随温和摇动。之后再次洗板拍干备用。
注1:一次制备的Galα1-3gal-BSA包被板可于4℃密封保存,一周内使用。
注2:配制碳酸盐缓冲液:称取碳酸钠0.3562g,碳酸氢钠0.8401g,用约80mL超纯水溶解,在pH仪下调整至pH
为9.5,定容至100mL。
5.3.2 剩余 M86抗体检测
分别取100μL5.2中准备的试验样品与 M86抗体反应后的反应物上清液(含有 M86剩余抗体)加
入固相抗原包被的96孔板中(每份样品3个复孔),用封口膜密封96孔板,置于37℃振荡孵育2h后,
用洗液洗板3次(伴随温和摇动)。加入IgM-HRP,37℃振荡孵育1h后,用洗液洗板3次(伴随温和摇
动)。加100μLTMB显色液避光显色15min,用10% H2SO450μL终止液显色后,在酶标仪上于
450nm 波长处测吸光度值。
6 抗原含量的计算
6.1 根据测定的吸光度值,计算各样品的 M86结合抑制率。
如果试验样品中α-Gal抗原微量或者痕量而难以定量时,应给出本次检测试验的最低检测限,表示
出低于最低检测限的水平。可同时对比检测脱细胞或去除抗原工艺前的样品,作为考察工艺有效性的
参考。
6.4 最低检测限的确定:
通过找到标准曲线最低稀释样品的检测OD值与Gal抗原阴性参考品检测OD值相等或相近的浓
度,这个浓度就是未能测定的浓度,从而确定其上一个浓度为本次试验的最低检测限。
7 试验可接受准则
7.1 Gal抗原阳性参考品的Gal抗原测定值与标准品定值的相对偏差(relativedeviation,RD)应小
于20%......
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