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| 标准编号 | GB 15193.13-2015 (GB15193.13-2015) | | 中文名称 | 食品安全国家标准 90天经口毒性试验 | | 英文名称 | National food safety standard - 90 days oral toxicity test | | 行业 | 国家标准 | | 中标分类 | C53 | | 国际标准分类 | 7.1 | | 字数估计 | 9,916 | | 发布日期 | 2015-08-07 | | 实施日期 | 2015-10-07 | | 旧标准 (被替代) | GB 15193.13-2003 | | 标准依据 | 食品安全国家标准的公告2015年第6号 | | 发布机构 | 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会 | GB 15193.13-2015: 食品安全国家标准 90天经口毒性试验
GB 15193.13-2015 英文名称: National food safety standard - 90 days oral toxicity test
1 范围
本标准规定了实验动物90天经口毒性试验的基本试验方法和技术要求。
本标准适用于评价受试物的亚慢性毒性作用。
2 术语和定义
2.1 亚慢性毒性
实验动物在不超过其寿命期限10%的时间内(大鼠通常为90d),重复经口接触受试物后引起的健
康损害效应。
2.2 未观察到有害作用剂量
通过动物试验,以现有的技术手段和检测指标未观察到任何与受试物有关的毒性作用的最大剂量。
2.3 最小观察到有害作用剂量
在规定的条件下,受试物引起实验动物组织形态、功能、生长发育等有害效应的最小作用剂量。
2.4 靶器官
实验动物出现由受试物引起明显毒性作用的器官。
2.5 卫星组
在毒性研究设计和实施中外加的动物组,其处理和饲养条件与主要研究的动物相似,用于试验中期
或试验结束恢复期观察和检测,也可用于不包括在主要研究内的其他指标及参数的观察和检测。
3 试验目的和原理
确定在90d内经口重复接触受试物引起的毒性效应,了解受试物剂量-反应关系、毒作用靶器官和
可逆性,得出90d经口最小观察到有害作用剂量(LOAEL)和未观察到有害作用剂量(NOAEL),初步
确定受试物的经口安全性,并为慢性毒性试验剂量、观察指标、毒性终点的选择以及获得“暂定的人体健康指导值”提供依据。
4 仪器和试剂
4.1 仪器/器械
实验室常用解剖器械、电子天平、生物显微镜、检眼镜、血生化分析仪、血液分析仪、凝血分析仪、尿液分析仪、心电图扫描仪、离心机、病理切片机等。
4.2 试剂
甲醛、二甲苯、乙醇、苏木素、伊红、石蜡、血球分析仪稀释剂、血生化分析试剂、凝血分析试剂、尿液分析试剂(或试纸)等。
5 试验方法
5.1 受试物
受试物应使用原始样品,若不能使用原始样品,应按照受试物处理原则对受试物进行适当处理。将
受试物掺入饲料、饮用水或灌胃给予。
5.2 实验动物
5.2.1 动物选择
实验动物的选择应符合GB 14922.1和GB 14922.2的有关规定。选择已有资料证明对受试物敏感
的动物物种和品系,一般啮齿类动物首选大鼠,非啮齿类动物首选犬(通常选用Beagle犬)。大鼠周龄
推荐不超过6周,体重50g~100g。试验开始时每个性别动物体重差异不应超过平均体重的±20%,
每组动物数不少于20只,雌雄各半;若计划试验中期观察或试验结束做恢复期的观察,应增加动物数
(对照和高剂量增加卫星组,每组10只,雌雄各半)。犬通常选用4个月~6个月的幼犬,一般不超过
9个月,试验开始时每个性别动物体重差异不应超过平均体重的±20%,每组动物数不少于8只,雌雄
各半;若计划试验中间尸检或试验结束做恢复期的观察,应增加动物数(对照和高剂量增加卫星组,每组
4只,雌雄各半)。对照组动物性别和数量应与受试物组相同。
5.2.2 动物准备
试验前大鼠在实验动物房至少应进行3d~5d(犬7d~14d)环境适应和检疫观察。
5.2.3 动物饲养
实验动物饲养条件应符合GB 14925、饮用水应符合GB 5749、饲料应符合GB 14924的有关规定。
试验期间动物自由饮水和摄食,动物推荐单笼饲养,大鼠也可按组分性别分笼群饲,每笼动物数(一般不
超过3只)应满足实验动物最低需要的空间,以不影响动物自由活动和观察动物的体征为宜。试验期间
每组动物非试验因素死亡率应小于10%,濒死动物应尽可能进行血液生化指标检测、大体解剖以及病
理组织学检查,每组生物标本损失率应小于10%。
5.3 剂量
5.3.1 分组
试验至少设3个受试物剂量组,1个阴性(溶媒)对照组,必要时增设未处理对照组。若试验中期需
要观察血液生化指标、尸检或试验结束做恢复期观察,对照和高剂量需增设卫星组。对照组除不给受试物外,其余处理均同受试物剂量组。
5.3.2 剂量设计
5.3.2.1 原则上高剂量应使部分动物出现比较明显的毒性反应,但不引起死亡;低剂量不宜出现任何观
察到毒效应(相当于NOAEL),且高于人的实际接触水平;中剂量介于两者之间,可出现轻度的毒性效
应,以得出NOAEL和(或)LOAEL。一般递减剂量的组间距以2倍~4倍为宜,如受试物剂量总跨度
过大可加设剂量组。试验剂量的设计参考急性毒性LD50剂量、28天经口毒性试验剂量和人体推荐摄入量进行。
5.3.2.2 能求出LD50的受试物,以28天经口毒性试验的NOAEL或LOAEL作为90天经口毒性试验
的最高剂量组;或以LD50的5%~15%作为最高剂量组,此LD50百分比的选择主要参考LD50剂量反应
曲线的斜率。然后在此剂量下设几个剂量组,最低剂量组至少是人体推荐摄入量的3倍。
5.3.2.3 求不出LD50的受试物,试验剂量应尽可能涵盖人体预期摄入量100倍的剂量,在不影响动物
摄食及营养平衡前提下应尽量提高高剂量组的剂量,对于人体推荐摄入量较大的受试物,高剂量组亦可
以按最大给予量设计。
5.4 试验步骤和观察指标
5.4.1 受试物给予
5.4.1.1 根据受试物的特性或试验目的,选择受试物掺入饲料、饮水或灌胃方式给予。若受试物影响动
物适口性,应灌胃给予。受试物应连续给予90d。
5.4.1.2 受试物灌胃给予,要将受试物溶解或悬浮于合适的溶媒中,首选溶媒为水、不溶于水的受试物
可使用植物油(如橄榄油、玉米油等),不溶于水或油的受试物亦可使用羧甲基纤维素、淀粉等配成混悬液或糊状物等。受试物应新鲜配制,有资料表明其溶液或混悬液储存稳定者除外。为保证受试物在动物体内浓度的稳定性,每日同一时段灌胃1次(每周灌胃6d)。试验期间,前4周每周称体重2次,之后
每周称体重1次,按体重调整灌胃体积。灌胃体积一般不超过10mL/kg体重,如为水溶液时,最大灌
胃体积大鼠可达20mL/kg体重,犬为15mL/kg体重;如为油性液体,灌胃体积应不超过4mL/kg体
重;各组灌胃体积一致。
5.4.1.3 受试物掺入饲料或饮水给予,要将受试物与饲料(或饮水)充分混匀并保证该受试物配制的稳
定性和均一性,以不影响动物摄食、营养平衡和饮水量为原则,受试物掺入饲料比例一般小于质量分数
5%,若超过5%时(最大不应超过10%),可调整对照组饲料营养素水平(若受试物无热量或营养成分,
且添加比例大于5%时,对照组饲料应填充甲基纤维素等,掺入量等同高剂量),使其与剂量组饲料营养
素水平保持一致,同时增设未处理对照组;亦可视受试物热量或营养成分的状况调整剂量组饲料营养素
水平,使其与对照组饲料营养素水平保持一致。受试物剂量单位是每千克体重所摄入受试物的毫克(或
克)数,即 mg/kg体重(或g/kg体重),当受试物掺入饲料其剂量单位亦可表示为 mg/kg(或g/kg)饲
料,掺入饮水则表示为mg/mL水。受试物掺入饲料时,需将受试物剂量(mg/kg体重)按动物每100g
体重的摄食量折算为受试物饲料浓度(mg/kg饲料),一般90天经口毒性试验大鼠每日摄食量按体重
8%折算。
5.4.2 一般临床观察
观察期限为90d,若设恢复期观察,动物应停止给予受试物后继续观察28d,以观察受试物毒性的
可逆性、持续性和迟发效应。试验期间至少每天观察一次动物的一般临床表现,并记录动物出现中毒的体征、程度和持续时间及死亡情况。观察内容包括被毛、皮肤、眼、黏膜、分泌物、排泄物、呼吸系统、神经系统、自主活动(如:流泪、竖毛反应、瞳孔大小、异常呼吸)及行为表现(如:步态、姿势、对处理的反应、有无强直性或阵挛性活动、刻板反应、反常行为等)。对体质弱的动物应隔离,濒死和死亡动物应及时解剖。
5.4.3 体重和摄食及饮水消耗量
每周记录体重、摄食量,计算食物利用率;试验结束时,计算动物体重增长量、总摄食量、总食物利用
率。受试物经饮水给予,应每日记录饮水量。如受试物经掺入饲料或饮水给予,应计算和报告受试物各
剂量组实际摄入剂量。
5.4.4 眼部检查
在试验前和试验结束时,至少对高剂量组和对照组大鼠进行眼部检查(角膜、晶状体、球结膜、虹
膜),犬用荧光素钠进行检查,若发现高剂量组动物有眼部变化,则应对所有动物进行检查。
5.4.5 血液学检查大鼠试验中期(卫星组)、试验结束、恢复期结束(卫星组)进行血液学指标测定;犬试验前、试验期间(45d)、试验结束、恢复期结束(卫星组)进行血液学指标测定。推荐指标为白细胞计数及分类(至少三分类)、红细胞计数、血红蛋白浓度、红细胞压积、血小板计数、凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)等。如果对血液系统有影响,应加测网织红细胞、骨髓涂片细胞学检查。
5.4.6 血生化学检查
大鼠试验中期(卫星组)、试验结束、恢复期结束(卫星组)进行血液生化指标测定;犬试验前、试验期
间(45d)、试验结束、恢复期结束(卫星组)进行血液生化指标测定,应空腹采血。测定指标应包括电解
质平衡、糖、脂和蛋白质代谢、肝(细胞、胆管)肾功能等方面。至少包含丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、谷氨酰转肽酶(GGT)、尿素(Urea)、肌酐(Cr)、血糖(Glu)、总蛋白(TP)、白蛋白(Alb)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、氯、钾、钠指标。必要时可检测钙、磷、尿酸(UA)、总胆汁酸(TBA)、胆碱酯酶、山梨醇脱氢酶......
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