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[PDF] GB 4789.13-2012 - 自动发货, 英文版

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GB 4789.13-2012 英文版 210 GB 4789.13-2012 3分钟内自动发货[PDF] 食品安全国家标准 食品微生物学检验 产气荚膜梭菌检验 有效

基本信息
标准编号 GB 4789.13-2012 (GB4789.13-2012)
中文名称 食品安全国家标准 食品微生物学检验 产气荚膜梭菌检验
英文名称 National food safety standards. Microbiological examination of food. Clostridium perfringens inspection
行业 国家标准
中标分类 C53
国际标准分类 07.100.30
字数估计 11,124
旧标准 (被替代) GB/T 4789.13-2003
标准依据 卫生部公告2012年第9号
发布机构 中华人民共和国卫生部
范围 本标准规定了食品中产气英膜梭菌(Clostridium perfringens)的检验方法。本标准适用于食品中产气英膜梭菌的检验。

GB 4789.13-2012 中华人民共和国国家标准 食品安全国家标准 食品微生物学检验 产气荚膜梭菌检验 中华人民共和国卫生部 发布 2012-05-17发布 2012-07-17实施 前言 本标准代替 GB/T 4789.13-2003《食品卫生微生物学检验 产气荚膜梭菌检验》。 本标准与 GB/T 4789.13-2003相比,主要变化如下: --修改了标准的中文名称; --修改了样品制备过程; --修改了培养基与试剂; --修改了操作步骤; --修改了菌数计算部分; --增加了附录 A。 食品安全国家标准 食品微生物学检验 产气荚膜梭菌检验 1 范围 本标准规定了食品中产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的检验方法。 本标准适用于食品中产气荚膜梭菌的检验。 2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下: a) 恒温培养箱:36℃±1 ℃; b) 冰箱:2 ℃~5℃; c) 恒温水浴箱:50℃±1 ℃,46℃±0.5℃; d) 天平:感量 0.1 g; e) 均质器; f) 显微镜:10×~100×; g) 无菌吸管:1 mL(具 0.01 mL 刻度)、10 mL(具 0.1 mL 刻度)或微量移液器及吸头; h) 无菌试管:18mm×180mm; i) 无菌培养皿:直径 90 mm; j) pH计或 pH比色管或精密 pH试纸; k) 厌氧培养装置。 3 培养基和试剂 3.1 胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸(TSC)琼脂:见附录 A中 A.1。 3.2 液体硫乙醇酸盐培养基(FTG):见附录 A中 A.2。 3.3 缓冲动力-硝酸盐培养基:见附录 A中 A.3。 3.4 乳糖-明胶培养基:见附录 A中 A.4。 3.5 含铁牛乳培养基:见附录 A中 A.5。 3.6 0.1%蛋白胨水:见附录 A 中 A.6。 3.7 革兰氏染色液:见附录 A中 A.7。 3.8 硝酸盐还原试剂:见附录 A中 A.8。 3.9 缓冲甘油-氯化钠溶液:见附录 A 中 A.9。 4 检验程序 产气荚膜梭菌检验程序见图 1。 图 1 产气荚膜梭菌检验程序 5 操作步骤 5.1 样品制备 5.1.1 样品采集后应尽快检验,若不能及时检验,可在 2 ℃~5 ℃保存;如 8 h 内不能进行检验,应以 无菌操作称取 25 g(mL)样品加入等量缓冲甘油-氯化钠溶液(液体样品应加双料),并尽快至于-60℃ 低温冰箱中冷冻保存或加干冰保存。 5.1.2 以无菌操作称取 25 g(mL)样品放入含有 225 mL 0.1%蛋白胨水(如为 5.1.1 中冷冻保存样品, 室温解冻后,加入 200 mL 0.1%蛋白胨水)的均质袋中,在拍击式均质器上连续均质 1 min~2 min;或 置于盛有 225 mL0.1%蛋白胨水的均质杯中,8 000 r/min~10 000 r/min 均质 1min~2 min,作为 1:10稀释 液。 5.1.3 以上述 1:10 稀释液按 1 mL 加 0.1%蛋白胨水 9 mL 制备 10-2~10-6的系列稀释液。 检 样 25g(mL)检样+225 mL0.1%蛋白胨水 均质、稀释 10-1~10-6稀释液各 1mL + TSC 琼脂混合 厌氧培养,36℃±1℃、20h~24h,黑色菌落计数 任选黑色菌落 5 个,分别接种 FTG培养基 确证试验 镜检形态 乳糖-明胶动力-硝酸盐牛奶发酵 报告 5.2 培养 5.2.1 吸取各稀释液 1 mL 加入无菌平皿内,每个稀释度做两个平行。每个平皿倾注冷却至 50 ℃的 TSC 琼脂(可放置于 50 ℃±1℃恒温水浴箱中保温)15 mL,缓慢旋转平皿,使稀释液和琼脂充分混匀。 5.2.2 上述琼脂平板凝固后,再加 10 mL 冷却至 50 ℃的 TSC琼脂(可放置于 50℃±1℃恒温水浴箱 中保温)均匀覆盖平板表层。 5.2.3 待琼脂凝固后,正置于厌氧培养装置内,36 ℃±1 ℃培养 20 h~24 h。 5.2.4 典型的产气荚膜梭菌在 TSC 琼脂平板上为黑色菌落。 5.3 确证试验 5.3.1 从单个平板上任选 5 个(小于 5 个全选)黑色菌落,分别接种到 FTG 培养基,36℃±1℃培养 18 h~24 h。 5.3.2 用上述培养液涂片,革兰氏染色镜检并观察其纯度。产气荚膜梭菌为革兰氏阳性粗短的杆菌,有 时可见芽孢体。如果培养液不纯,应划线接种 TSC 琼脂平板进行分纯,36 ℃±1 ℃厌氧培养 20 h~24 h, 挑取单个典型黑色菌落接种到 FTG培养基,36 ℃±1 ℃培养 18 h~24 h,用于后续的确证试验。 5.3.3 取生长旺盛的 FTG 培养液 1 mL 接种于含铁牛乳培养基,在 46℃±0.5℃水浴中培养 2 h后,每 小时观察一次有无“暴烈发酵”现象,该现象的特点是乳凝结物破碎后快速形成海绵样物质,通常会上 升到培养基表面。5 h 内不发酵者为阴性。产气荚膜梭菌发酵乳糖,凝固酪蛋白并大量产气,呈“暴烈发 酵”现象,但培养基不变黑。 5.3.4 用接种环(针)取 FTG培养液穿刺接种缓冲动力-硝酸盐培养基,于 36℃±1 ℃培养 24 h。在透 射光下检查细菌沿穿刺线的生长情况,判定有无动力。有动力的菌株沿穿刺线呈扩散生长,无动力的菌 株只沿穿刺线生长。然后滴加 0.5 mL 试剂甲和 0.2 mL 试剂乙以检查亚硝酸盐的存在。15 min 内出现红 色者,表明硝酸盐被还原为亚硝酸盐;如果不出现颜色变化,则加少许锌粉,放置 10 min,出现红色者, 表明该菌株不能还原硝酸盐。产气荚膜梭菌无动力,能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。 5.3.5 用接种环(针)取 FTG 培养液穿刺接种乳糖-明胶培养基,于 36℃±1℃培养 24 h,观察结果。 如发现产气和培养基由红变黄,表明乳糖被发酵并产酸。将试管于 5℃左右放置 1 h,检查明胶液化情况。 如果培养基是固态,于 36℃±1 ℃再培养 24 h,重复检查明胶是否液化。产气荚膜梭菌能发酵乳糖,使 明胶液化。 6 结果与报告 6.1 典型菌落计数 选取典型菌落数在 20 CFU~200 CFU 之间的平板,计数典型菌落数。如果: a) 只有一个稀释度平板的典型菌落数在 20CFU~200CFU 之间,计数该稀释度平板上的典型菌落; b)最低稀释度平板的典型菌落数均小于 20 CFU,计数该稀释度平板上的典型菌落; c)某一稀释度平板的典型菌落数均大于 200 CFU,但下一稀释度平板上没有典型菌落,应计数该稀 释度平板上的典型菌落; d)某一稀释度平板的典型菌落数均大于 200 CFU,且下一稀释度平板上有典型菌落,但其平板上的 典型菌落数不在 20 CFU~200 CFU 之间,应计数该稀释度平板上的典型菌落; e)2 个连续稀释度平板的典型菌落数均在 20CFU~200CFU之间,分别计数 2 个稀释度平板上的典 型菌落。 6.2 结果计算 6.1计数结果按公式(1)计算: (1) 式中: T--样品中产气荚膜梭菌的菌落数; A--单个平板上典型菌落数; B--单个平板上经确证试验为产气荚膜梭菌的菌落数; C--单个平板上用于确证试验的菌落数; --第一稀释度(低稀释倍数)经确证试验有产气荚膜梭菌的平板个数; --第二稀释度(高稀释倍数)经确证试验有产气荚膜梭菌的平板个数; 0.1--稀释系数; d--稀释因子(第一稀释度)。 6.3 报告 根据 TSC 琼脂平板上产气荚膜梭菌的典型菌落数,按照 6.2中公式计算,报告每 g(mL)样品中产 气荚膜梭菌数,报告单位以 CFU/g(mL)表示;如 T值为 0,则以小于 1 乘以最低稀释倍数报告。 dnn )1.0( )( 21 + 附录 A 培养基和试剂 A.1 胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸(TSC)琼脂 A.1.1 基础成分 胰胨 15.0 g 大豆胨 5.0 g 酵母粉 5.0 g 焦亚硫酸钠 1.0 g 柠檬酸铁铵 1.0 g 琼脂 15.0 g 蒸馏水 900.0 mL pH 7.6±0.2 A.1.2 D-环丝氨酸溶液 溶解 1 gD-环丝氨酸于 200 mL 蒸馏水,膜过滤除菌后,于 4 ℃冷藏保存备用。 A.1.3 制法 将基础成分加热煮沸至完全溶解,调节 pH,分装到 500 mL 烧瓶中,每瓶 250 mL,121℃高压灭菌 15 min,于 50 ℃±1 ℃保温备用。临用前每 250 mL 基础溶液中加入 20 mL D-环丝氨酸溶液,混匀,倾注 平皿。 A.2 液体硫乙醇酸盐培养基(FTG) A.2.1 成分 胰蛋白胨 15.0 g L-胱氨酸 0.5g 酵母粉 5.0 g 葡萄糖 5.0 g 氯化钠 2.5g 硫乙醇酸钠 0.5g 刃天青 0.001g 琼脂 0.75g 蒸馏水 1 000.0 mL pH 7.1±0.2 A.2.2 制法 将以上成分加热煮沸至完全溶解,冷却后调节 pH,分装试管,每管 10 mL,121 ℃高压灭菌 15 min。 临用前煮沸或流动蒸汽加热 15 min,迅速冷却至接种温度。 A.3 缓冲动力-硝酸盐培养基 A.3.1 成分 蛋白胨 5.0 g 牛肉粉 3.0 g 硝酸钾 5.0 g 磷酸氢二钠 2.5g 半乳糖 5.0 g 甘油 5.0 mL 琼脂 3.0 g 蒸馏水 1 000.0 mL pH 7.3±0.2 A.3.2 制法 将以上成分加热煮沸至完全溶解,调节 pH,分装试管,每管 10 mL,121 ℃高压灭菌 15 min。如果 当天不用,置 4℃左右冷藏保存。临用前煮沸或流动蒸汽加热 15 min,迅速冷却至接种温度。 A.4 乳糖-明胶培养基 A.4.1 成分 蛋白胨 15.0 g 酵母粉 10.0 g 乳糖 10.0 g 酚红 0.05g 明胶 120.0 g 蒸馏水 1 000.0 mL pH 7.5±0.2 A.4.2制法 加热溶解蛋白胨、酵母粉和明胶于 1000 mL蒸馏水中,调节 pH,加入乳糖和酚红。分装试管,每 管 10 mL,121 ℃高压灭菌 10 min。如果当天不用,置 4℃左右冷藏保存。临用前煮沸或流动蒸汽加热 15 min,迅速冷却至接种温度。 A.5 含铁牛乳培养基 A.5.1 成分 新鲜全脂牛奶 1 000.0 mL 硫酸亚铁(FeSO4·7H2O) 1.0 g 蒸馏水 50.0 mL A.5.2 制法 将硫酸亚铁溶于蒸馏水中,不断搅拌,缓慢加入 1000 mL 牛奶中,混匀。分装大试管,每管 10 mL, 118℃高压灭菌 12 min。本培养基必须新鲜配制。 A.6 0.1% 蛋白胨水 A.6.1 成分 蛋白胨 1.0 g 蒸馏水 1 000.0 mL pH 7.0±0.2 A.6.2制法 加热溶解,调节 pH,121℃高压灭菌 15 min。 A.7 革兰氏染色液 A.7.1 结晶紫染色液 A.7.1.1 成分 结晶紫 1.0g 95%乙醇 20.0 mL 1%草酸铵水溶液 80.0 mL A.7.1.2 制法 将结晶紫完全溶于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。 A.7.2 革兰氏碘液 A.7.2.1 成分 碘 1.0 g 碘化钾 2.0 g 蒸馏水 300.0 mL A.7.2.2 制法 将碘与碘化钾先混合,加入蒸馏水少许振摇,待完全溶解后,再加入蒸馏水至 300 mL。 A.7.3 沙黄复染液 A.7.3.1 成分 沙黄 0.25 g 95%乙醇 10.0 mL 蒸馏水 90.0 mL A.7.3.2 制法 将沙黄溶解于 95%乙醇中,然后用蒸馏水稀释。 A.7.4 染色方法 涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染液,染色 1 min,水洗。滴加革兰氏碘液,作用 1 min......