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| 标准编号 | GB 4789.41-2016 (GB4789.41-2016) | | 中文名称 | 食品安全国家标准 食品微生物学检验 肠杆菌科检验 | | 英文名称 | National Food Safety Standard -- Food Microbiological Examination -- Enterobacteriaceae | | 行业 | 国家标准 | | 中标分类 | C53 | | 字数估计 | 14,158 | | 发布日期 | 2016-08-31 | | 实施日期 | 2017-03-01 | | 标准依据 | 国家卫生和计划生育委员会公告2016年第11号 | GB 4789.41-2016
(Food safety national standard - Food microbiology - Examination of Enterobacteriaceae)
中华人民共和国国家标准
食品安全国家标准
食品微生物学检验 肠杆菌科检验
2016-08-31发布
2017-03-01实施
中 华 人 民 共 和 国
国家卫生和计划生育委员会 发 布
食品安全国家标准
食品微生物学检验 肠杆菌科检验
1 范围
本标准第一法适用于肠杆菌科含量较高的食品中肠杆菌科的计数;第二法适用于肠杆菌科含量较
低食品中肠杆菌科的计数。
2 术语和定义
2.1
肠杆菌科 Enterobacteriaceae
在给定条件下发酵葡萄糖产酸、氧化酶阴性的需氧或兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
2.2
按本标准规定方法,对每克或每毫升检样中的肠杆菌科进行计数。
2.3
最可能数 mostprobablenumber;MPN
基于泊松分布的一种间接计数方法。
3 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
3.1 恒温培养箱:36℃±1℃。
3.2 冰箱:2℃~5℃。
3.3 水浴箱:46℃±1℃。
3.4 天平:感量0.1g。
3.5 显微镜:10倍~100倍。
3.6 均质器。
3.7 振荡器。
3.8 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。
3.9 无菌锥形瓶或等效容器:容量150mL、500mL。
3.10 无菌培养皿:直径90mm。
3.11 无菌试管:18mm×180mm、15mm×150mm。
3.12 pH计或pH比色管或精密pH试纸。
4 培养基和试剂
4.1 缓冲蛋白胨水(BPW):见B.1。
4.2 缓冲葡萄糖煌绿胆盐肉汤(EE肉汤):见B.2。
4.3 结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂(VRBGA):见B.3。
4.4 营养琼脂(NA):见B.4。
4.5 葡萄糖琼脂:见B.5。
4.6 革兰氏染色液:见B.6。
4.7 氧化酶试剂:见B.7。
4.8 无菌1mol/LNaOH:见B.8。
4.9 无菌1mol/LHCl:见B.9。
第一法 肠杆菌科平板计数法
5 检验程序
肠杆菌科平板计数法检验程序见图1。
图1 肠杆菌科平板计数法检验程序
6 操作步骤
6.1 样品的稀释
6.1.1 固体和半固体样品:称取25g样品放入盛有225mLBPW 的无菌均质杯中,8000r/min~
10000r/min均质1min~2min,或放入盛有225mLBPW 的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打
1min~2min,制成1∶10的样品匀液。
6.1.2 液体样品:以无菌吸管吸取25mL样品放入盛有225mLBPW的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数
量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成1∶10的样品匀液。
6.1.3 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL,沿管壁缓缓注入盛有9mLBPW的
无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不应触及稀释液面),振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打,
使其混合均匀,制成1∶100的样品匀液。
6.1.4 按6.1.3操作程序,依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次,换用1支1mL无
菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程不得超过15min。
6.2 倾注平板和培养
6.2.1 根据对样品污染状况的估计及相关限量要求,选择2个~3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液
体样品可以选择原液),每个稀释度接种2个无菌平皿。同时,分别吸取1mLBPW 加入两个无菌平皿
内作为空白对照。
6.2.2 将10mL~15mL冷却至46℃的VRBGA(可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温)倾注于每
个平皿中。小心旋转平皿,使样品匀液与培养基充分混匀。
6.2.3 待琼脂凝固后,倾注一薄层同样的培养基覆盖平板表层。防止蔓延生长并使菌落特征更为
明显。
6.2.4 待VRBGA平板上层琼脂凝固后翻转平板,36℃±1℃培养18h~24h。
6.3 典型菌落计数和确认
6.3.1 肠杆菌科典型菌落为有或无沉淀环的粉红色至红色或紫色菌落。选取典型菌落数在15CFU~
150CFU之间、无蔓延菌落生长的平板,只计数典型菌落数。菌落计数以菌落形成单位(colony-
formingunits,CFU)表示。
6.3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释
度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以
2,代表一个平板菌落数。
6.3.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时,则将每条单链作为一个菌落计数。
6.3.4 从每个平板上至少挑取5个(小于5个全选)典型菌落进行确认;如果有不同形态的典型菌落,则
每种形态分别至少挑取1个菌落进行确认。
6.3.5 典型菌落的确认:
a) 分别将所挑选的每一个菌落,划线于营养琼脂平板,36℃±1℃培养18h~24h,挑取平板上
的菌落进行革兰氏染色镜检、氧化酶试验及葡萄糖发酵试验。
b) 革兰氏染色镜检:肠杆菌科为革兰氏阴性杆菌,无芽孢,大小为(0.3~1.0)μm×(1.0~
6.0)μm。
c) 氧化酶试验:用铂/铱接种环或玻璃棒(不要用镍铬接种环)挑取单个菌落涂于浸湿氧化酶试剂
的滤纸上,滤纸的颜色在10s内变成蓝紫色,判为阳性反应。
d) 葡萄糖发酵试验:用接种针挑取少许氧化酶阴性的同一个菌落,穿刺于葡萄糖琼脂内,于36℃±
1℃培养24h±2h,若试管内的内容物变为黄色,判为阳性反应。
6.4 结果的计算
6.4.1 一般原则
若有两个连续稀释度的平板典型菌落数在适宜计数范围内,按式(1)计算,示例见 A.1、A.2、
A.3、A.4。
N= ∑
(n1+0.1n2)d
(1)
式中:
N ---样品中肠杆菌科菌落数;
∑a---确证的肠杆菌科菌落数之和;
n1 ---第一稀释度(低稀释倍数)平板个数(含确证的肠杆菌科菌落);
n2 ---第二稀释度(高稀释倍数)平板个数(含确证的肠杆菌科菌落);
d ---稀释因子(第一稀释度)。
其中,a按式(2)计算:
a=
A ×C
(2)
式中:
a---确证的肠杆菌科菌落数;
b---某一平板中A 个菌落中被确证为肠杆菌科的菌落数,b≤A;
A---某一平板中用于确认试验的菌落数;
C---某一平板中典型菌落总数。
6.4.2 低菌落数
若最低稀释度(包括液体样品原液)平板的典型菌落数均小于15CFU,具有确证的肠杆菌科菌落,
则以确证的菌落数乘以最低稀释倍数计算。
若最低稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,或典型菌落数均小于15CFU,且无确证的
肠杆菌科菌落,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。
6.4.3 特殊情况
第一稀释度平板上的典型菌落数均大于150CFU,且有确证的肠杆菌科菌落,以及第二稀释度平
板上无确证的肠杆菌科菌落或典型菌落数不在15CFU~150CFU之间,则以确证的菌落数乘以第一
稀释倍数计算,示例见A.5。
若所有稀释度的平板上典型菌落数均不在适宜计数范围内,且无确证的肠杆菌科菌落,则以小于1
乘以最低稀释倍数计算。
7 报告
7.1 菌落数小于100时,以整数报告。
7.2 菌落数大于或等于100时,对第3位数字进行修约后,取前2位数字,后面用0代替位数;也可用
10的指数形式来表示,采用两位有效数字。
7.3 数字修约按“四舍五入”原则进行。
7.4 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数,则报告菌落蔓延。
7.5 若空白对照上有菌落生长,则此次检测结果无效。
7.6 称重取样以CFU/g为单位报告,体积取样以CFU/mL为单位报告。
第二法 肠杆菌科 MPN计数法
8 检验程序
肠杆菌科 MPN计数法检验程序见图2。
图2 肠杆菌科 MPN计数法检验程序
9 操作步骤
9.1 样品的稀释
按6.1进行。
9.2 接种和培养
9.2.1 非选择性前增菌
根据对样品污染状况的估计及相关限量要求,选择3个适宜连续稀释度的样品匀液,每个稀释度
3管,共9管BPW于36℃ ±1℃培养18h±2h。
9.2.2 选择性增菌
从BPW各培养管中,分别移取1mL培养物,接种于10mL的EE肉汤中,36℃±1℃培养24h±
2h。
9.2.3 分离
用接种环从EE各肉汤管中分别取培养物1环,划线接种于VRBGA平板,36℃±1℃培养24h±
2h,观察平板上有无典型菌落。
9.3 典型菌落的确认
典型菌落确认见6.3。
10 报告
肠杆菌科为革兰氏阴性无芽胞杆菌,发酵葡萄糖产酸、氧化酶阴性。只要有1个菌落确认为肠杆菌
科,其所代表的EE管即为肠杆菌科阳性,依据EE阳性管数查 MPN表(见附录C),报告每克(毫升)样
品中肠杆菌科的 MPN值。称重取样以 MPN/g为单位报告,体积取样以 MPN/mL为单位报告。
附 录 A
结果计算示例
A.1 两个连续稀释度均含适宜的典型菌落数平板,并含有已确证的肠杆菌科菌落,数据见表A.1。
表A.1 肠杆菌科平板计数结果示例1
稀释度 1∶100(第一稀释度) 1∶1000(第二稀释度)
典型菌落数/CFU 126 145 20 24
用于确认试验的菌落数/CFU 5 5 5 5
确证的菌落数/CFU 4 5 4 3
a 4/5×126=101 5/5×145=145 4/5×20=16 3/5×24=14
N=
101+145+16+14
[2+(0.1×2)]×10-2
0.022=12545
上述数据按7.2数字修约后,表示为13000或1.3×104。
A.2 两个连续稀释度均含适宜典型菌落数平板,其中某一稀释度的一个平板菌落数不在适宜范围内,
或者两个稀释度各有一个平板菌落数不在适宜范围内,则相应的平板不作为计数平板,数据见表A.2。
表A.2 肠杆菌科平板计数结果示例2
稀释度 1∶100(第一稀释度) 1∶1000(第二稀释度)
典型菌落数/CFU 126 118 20 10
用于确认试验的菌落数/CFU 5 8 5 -
确证的菌落数/CFU 4 5 4 -
a 4/5×126=101 5/8×118=74 4/5×20=16 -
N=
101+74+16
[2+(0.1×1)]×10-2
0.021=9095
上述数据按7.2数字修约后,表示为9100或9.1×103。
A.3 两个连续稀释度均含适宜典型菌落数平板,其中一个平板无已确证的肠杆菌科菌落,则相应的平
板不作为计数平板,数据见表A.3。
表A.3 肠杆菌科平板计数结果示例3
稀释度 1∶100(第一稀释度) 1∶1000(第二稀释度)
典型菌落数/CFU 126 118 20 20
用于确认试验的菌落数/CFU 5 6 5 5
确证的菌落数/CFU 4 6 4 0
a 4/5×126=101 6/6×118=118 4/5×20=16 0
N=
101+118+16+0
[2+(0.1×1)]×10-2
0.021=11190
上述数据按7.2数字修约后,表示为11000或1.1×104。
A.4 两个连续稀释度均含适宜典型菌落数平板,但无已确证的肠杆菌科菌落,则以小于1乘以最低稀
释倍数计算。
A.5 第一稀释度平板上的菌落数超过150CFU,且有证实的肠杆菌科菌落,以及第二稀释度平板上无
确证的肠杆菌科菌落或典型菌落数不在15CFU~150CFU之间,则以确证的菌落数乘以第一稀释倍
数计算,数据见表A.5。
表A.5 肠杆菌科平板计数结果示例5
稀释度 1∶100(第一稀释度) 1∶1000(第二稀释度)
典型菌落数/CFU 220 198 23 17
用于确认试验的菌落数/CFU 5 5 5 5
确证的菌落数/CFU 4 3 0 0
a 4/5×220=176 3/5×198=119 0 0
N= 176+1192
÷×102=14750
附 录 B
培养基和试剂
B.1 缓冲蛋白胨水(BPW)
B.1.1 成分
蛋白胨 10.0g
氯化钠 5.0g
磷酸氢二钠 3.5g
磷酸二氢钾 1.5g
蒸馏水 1000.0mL
B.1.2 制法
将B.1.1成分加热溶解,于25℃时调节pH至7.2±0.2,分装于500mL广口瓶中,每瓶225mL,
121℃高压灭菌15min。
B.2 缓冲葡萄糖煌绿胆盐肉汤(EE肉汤)
B.2.1 成分
蛋白胨 10.0g
葡萄糖 5.0g
磷酸氢二钠(无水) 6.45g
磷酸二氢钾 2.0g
牛胆盐 20.0g
煌绿 0.0135g
蒸馏水 1000.0mL
B.2.2 制法
将B.2.1成分溶于水中,加热煮沸至完全溶解,加热不宜超过30min,迅速冷却培养基,于25℃调
节pH至7.2±0.2,分装于灭菌的18mm×180mm试管中,每管10mL,不需高压灭菌,5℃±3℃可存
放一个月。
B.3 结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂(VRBGA)
B.3.1 成分
蛋白胨 7.0g
酵母浸膏 3.0g
3号胆盐 1.5g
葡萄糖 10.0g
氯化钠 5.0g
中性红 0.03g(或0.6%酒精溶液5mL)
结晶紫 0.002g(或0.1%水溶液2mL)
琼脂粉 10.0g~12.0g
蒸馏水 1000.0mL
B.3.2 制法
将B.3.1成分溶于水中,加热煮沸至完全溶解,25℃时调节pH至7.4±0.2,分装于灭菌的锥形烧
瓶中,不需高压灭菌,用前制备。倾注平板,使用前干燥平板。未干燥的平板5℃±3℃可存放两周。
B.4 营养琼脂(NA)
B.4.1 成分
牛肉浸膏 3.0g
蛋白胨 5.0g
琼脂粉 10.0g~12.0g
蒸馏水 1000.0mL
B.4.2 制法
将B.4.1成分溶于水中,加热煮沸,25℃时调节pH至7.3±0.2,121℃高压灭菌15min。倾注平
板,使用前干燥平板。未干燥的平板于5℃±3℃可存放两周。
B.5 葡萄糖琼脂
B.5.1 成分
胰蛋白胨 10.0g
酵母浸膏 1.5g
葡萄糖 10.0g
氯化钠 5.0g
溴甲酚紫 0.015g(或0.4%溴甲酚紫酒精溶液3.75mL)
琼脂粉 10.0g~12.0g
蒸馏水 1000.0mL
B.5.2 制法
将B.5.1成分溶于水中,加热煮沸,25℃时调节pH至7.0±0.2,分装于15mm×150mm试管,每
管约5mL,121℃高压灭菌15min后,试管垂直放置。于5℃±3℃可存放1周。为去除培养基中的
氧气,使用前可将葡萄糖琼脂试管置于沸水浴中15min,然后迅速冷却,备用。
B.6 革兰氏染色液
B.6.1 结晶紫染色液
B.6.1.1 成分
结晶紫 1.0g
95%乙醇 20.0mL
1%草酸铵水溶液 80.0mL
B.6.1.2 制法
将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。
B.6.2 革兰氏碘液
B.6.2.1 成分
碘 1.0g
碘化钾 2.0g
蒸馏水 300.0mL
B.6.2.2 制法
将碘和碘化钾先行混合,加入少许蒸馏水充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至300mL。
B.6.3 沙黄复染液
B.6.3.1 成分
沙黄 0.25g
95%乙醇 10.0mL
蒸馏水 90.0mL
B.6.3.2 制法
将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释。
B.6.4 染色方法
B.6.4.1 将涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染色液,染1min,水洗。
B.6.4.2 滴加革兰氏碘液,作用1min,水洗。
B.6.4.3 滴加95%乙醇脱色15s~30s,直至染色液被洗掉,但不要过分脱色、水洗。
B.6.4.4 加沙黄复染液,复染1min,水洗、干燥、镜检。
B.6.4.5 革兰氏阳性菌呈紫色,革兰氏阴性菌呈红色。
B.7 氧化酶试剂
B.7.1 成分
N,N,N',N'-四甲基对苯二胺盐酸盐 1.0g
蒸馏水 100.0mL
B.7.2 制法
将B.7.1成分溶解于冷水中,少量新鲜配制。
B.7.3 试验方法
用细玻璃棒或一次性接种针挑去单个菌落,涂布在氧化酶试剂湿润的滤纸上。在10s内呈现粉红
或紫红色,即为氧化酶试验阳性。不变色者为氧化酶试验阴性。
B.8 无菌1mol/LNaOH
B.8.1 成分
NaOH 40.0g
蒸馏水 1000.0mL
B.8.2 制法
称取40g氢氧化钠溶于1000mL蒸馏水中,121℃高压灭菌15min。
B.9 无菌1mol/LHCl
B.9.1 成分
HCl 90.0mL
蒸馏水 1000.0mL
B.9.2 制法
移取浓盐酸90mL,用蒸馏水稀释至1000mL,121℃高压灭菌15min。
附 录 C
肠杆菌科最可能数(MPN)检索表
每克(毫升)检样中肠杆菌科最可能数(MPN)的检索见表C.1。
表C.1 肠杆菌科最可能数(MPN)的检索表
阳性管数
0.10 0.01 0.001
MPN
95%置信区间
下限 上限
阳性管数
0.10 0.01 0.001
MPN
95%置信区间
下限 上限
0 0 0 < 3.0 - 9.5 2 2 0 21 4.5 42
0 0 1 3.0 0.15 9.6 2 2 1 28 8.7 94
0 1 0 3.0 0.15 11 2 2 2 35 8.7 94
0 1 1 6.1 1.2 18 2 3 0 29 8.7 94
0 2 0 6.2 1.2 18 2 3 1 36 8.7 94
0 3 0 9.4 3.6 38 3 0 0 23 4.6 94
1 0 0 3.6 0.17 18 3 0 1 38 8.7 110
1 0 1 7.2 1.3 18 3 0 2 ......
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