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| 标准编号 | GB 5009.22-2016 (GB5009.22-2016) | | 中文名称 | 食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定 | | 英文名称 | Determination of aflatoxin B1, B2, G1, G2, M1, M2 content in milk and milk powder -- HPLC-fluorescence detection method | | 行业 | 国家标准 | | 中标分类 | X04 | | 国际标准分类 | 67.050 | | 字数估计 | 37,398 | | 发布日期 | 2016-12-23 | | 实施日期 | 2017-06-23 | | 旧标准 (被替代) | GB 5009.24-2010 Partly; GB/T 18979-2003; GB/T 23212-2008 Partly; GB/T 5009.22-2003; GB/T 5009.23-2006; NY/T 1286-2007; SN 0339-1995; SN/T 1101-2002; SN/T 1664-2005 Partly; SN/T 1736-2006 | | 标准依据 | National Health and Family Planning Commission Notice No.17 of 2016 | | 发布机构 | 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会、国家食品药品监督管理总局 | | 范围 | 本标准规定了食品中黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2(以下简称AFT B1、AFT B2 、AFT G1和AFT G2)的测定方法。本标准第一法为同位素稀释液相色谱-串联质谱法，适用于谷物及其制品、豆类及其制品、坚果及籽类、油脂及其制品、调味品、婴幼儿配方食品和婴幼儿辅助食品中AFT B1、AFT B2 、AFT G1和AFT G2的测定。本标准第二法为高效液相色谱一柱前衍生法，适用于谷物及其制品、豆类及其制品、坚果及籽类、油脂及其制品、调味品、婴幼儿配方食品和婴幼儿辅助食品中 | GB 5009.22-2016: 食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定
GB 5009.22-2016 英文名称: Determination of aflatoxin B1, B2, G1, G2, M1, M2 content in milk and milk powder -- HPLC-fluorescence detection method
中华人民共和国国家标准
1 范围
本标准规定了食品中黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2(以下简称
AFTB1、AFTB2、AFTG1和AFTG2)的测定方法。
本标准第一法为同位素稀释液相色谱-串联质谱法,适用于谷物及其制品、豆类及其制品、坚果及籽
类、油脂及其制品、调味品、婴幼儿配方食品和婴幼儿辅助食品中AFTB1、AFTB2、AFTG1和AFTG2的测定。
本标准第二法为高效液相色谱-柱前衍生法,适用于谷物及其制品、豆类及其制品、坚果及籽类、油
脂及其制品、调味品、婴幼儿配方食品和婴幼儿辅助食品中 AFTB1、AFTB2、AFTG1和 AFTG2的测定。
本标准第三法为高效液相色谱-柱后衍生法,适用于谷物及其制品、豆类及其制品、坚果及籽类、油
脂及其制品、调味品、婴幼儿配方食品和婴幼儿辅助食品中 AFTB1、AFTB2、AFTG1和 AFTG2的测定。
本标准第四法为酶联免疫吸附筛查法,适用于谷物及其制品、豆类及其制品、坚果及籽类、油脂及其
制品、调味品、婴幼儿配方食品和婴幼儿辅助食品中AFTB1的测定。
本标准第五法为薄层色谱法,适用于谷物及其制品、豆类及其制品、坚果及籽类、油脂及其制品、调味品中AFTB1的测定。
第一法 同位素稀释液相色谱-串联质谱法
5 分析步骤
使用不同厂商的免疫亲和柱,在样品上样、淋洗和洗脱的操作方面可能会略有不同,应该按照供应
商所提供的操作说明书要求进行操作。
警示:整个分析操作过程应在指定区域内进行。该区域应避光(直射阳光)、具备相对独立的操作台
和废弃物存放装置。在整个实验过程中,操作者应按照接触剧毒物的要求采取相应的保护措施。
5.1 样品制备
5.1.1 液体样品(植物油、酱油、醋等)
采样量需大于1L,对于袋装、瓶装等包装样品需至少采集3个包装(同一批次或号),将所有液体
样品在一个容器中用匀浆机混匀后,其中任意的100g(mL)样品进行检测。
5.1.2 固体样品(谷物及其制品、坚果及籽类、婴幼儿谷类辅助食品等)
采样量需大于1kg,用高速粉碎机将其粉碎,过筛,使其粒径小于2mm孔径试验筛,混合均匀后缩
分至100g,储存于样品瓶中,密封保存,供检测用。
5.1.3 半流体(腐乳、豆豉等)
采样量需大于1kg(L),对于袋装、瓶装等包装样品需至少采集3个包装(同一批次或号),用组织
捣碎机捣碎混匀后,储存于样品瓶中,密封保存,供检测用。
5.2 样品提取
5.2.1 液体样品
5.2.1.1 植物油脂
称取5g试样(精确至0.01g)于50mL离心管中,加入100μL同位素内标工作液(3.4.3)振荡混合
后静置30min。加入20mL乙腈-水溶液(84+16)或甲醇-水溶液(70+30),涡旋混匀,置于超声波/涡
旋振荡器或摇床中振荡20min(或用均质器均质3min),在6000r/min下离心10min,取上清液备用。
5.2.1.2 酱油、醋
称取5g试样(精确至0.01g)于50mL离心管中,加入125μL同位素内标工作液振荡混合后静置
30min。用乙腈或甲醇定容至25mL(精确至0.1mL),涡旋混匀,置于超声波/涡旋振荡器或摇床中振
荡20min(或用均质器均质3min),在6000r/min下离心10min(或均质后玻璃纤维滤纸过滤),取上清液备用。
5.2.2 固体样品
5.2.2.1 一般固体样品
称取5g试样(精确至0.01g)于50mL离心管中,加入100μL同位素内标工作液振荡混合后静置
30min。加入20.0mL乙腈-水溶液(84+16)或甲醇-水溶液(70+30),涡旋混匀,置于超声波/涡旋振
荡器或摇床中振荡20min(或用均质器均质3min),在6000r/min下离心10min(或均质后玻璃纤维滤纸过滤),取上清液备用。
5.2.2.2 婴幼儿配方食品和婴幼儿辅助食品
称取5g试样(精确至0.01g)于50mL离心管中,加入100μL同位素内标工作液振荡混合后静置
30min。加入20.0mL乙腈-水溶液(50+50)或甲醇-水溶液(70+30),涡旋混匀,置于超声波/涡旋振
荡器或摇床中振荡20min(或用均质器均质3min),在6000r/min下离心10min(或均质后玻璃纤维滤纸过滤),取上清液备用。
5.2.3 半流体样品
称取5g试样(精确至0.01g)于50mL离心管中,加入100μL同位素内标工作液振荡混合后静置
30min。加入20.0mL乙腈-水溶液(84+16)或甲醇-水溶液(70+30),置于超声波/涡旋振荡器或摇床
中振荡20min(或用均质器均质3min),在6000r/min下离心10min(或均质后玻璃纤维滤纸过滤),取上清液备用。
5.3 样品净化
5.3.1 免疫亲和柱净化
5.3.1.1 上样液的准备
准确移取4mL上清液,加入46mL1% TritionX-100(或吐温-20)的PBS(使用甲醇-水溶液提取时可减半加入),混匀。
5.3.1.2 免疫亲和柱的准备
将低温下保存的免疫亲和柱恢复至室温。
5.3.1.3 试样的净化
待免疫亲和柱内原有液体流尽后,将上述样液移至50mL注射器筒中,调节下滴速度,控制样液以
1mL/min~3mL/min的速度稳定下滴。待样液滴完后,往注射器筒内加入2×10mL水,以稳定流速
淋洗免疫亲和柱。待水滴完后,用真空泵抽干亲和柱。脱离真空系统,在亲和柱下部放置10mL刻度
试管,取下50mL的注射器筒,加入2×1mL甲醇洗脱亲和柱,控制1mL/min~3mL/min的速度下
滴,再用真空泵抽干亲和柱,收集全部洗脱液至试管中。在50℃下用氮气缓缓地将洗脱液吹至近干,加
入1.0mL初始流动相,涡旋30s溶解残留物,0.22μm滤膜过滤,收集滤液于进样瓶中以备进样。
5.3.2 黄曲霉毒素固相净化柱和免疫亲和柱同时使用(对花椒、胡椒和辣椒等复杂基质)
5.3.2.1 净化柱净化
移取适量上清液,按净化柱操作说明进行净化,收集全部净化液。
5.3.2.2 免疫亲和柱净化
用刻度移液管准确吸取上述净化液4mL,加入46mL1% TritionX-100(或吐温-20)的PBS[使用甲
醇-水溶液提取时,加入23mL1%TritionX-100(或吐温-20)的PBS],混匀。按5.3.1.2和5.3.1.3处理。
注:全自动(在线)或半自动(离线)的固相萃取仪器可优化操作参数后使用。
5.6 定性测定
试样中目标化合物色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间相比较,变化范围应在±2.5%之内。
每种化合物的质谱定性离子必须出现,至少应包括一个母离子和两个子离子,而且同一检测批次,
对同一化合物,样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比,其允许偏差
不超过表3规定的范围。
5.7 标准曲线的制作
在5.4、5.5的液相色谱串联质谱仪分析条件下,将标准系列溶液由低到高浓度进样检测,以AFTB1、
AFTB2、AFTG1和AFTG2色谱峰与各对应内标色谱峰的峰面积比值-浓度作图,得到标准曲线回归方
程,其线性相关系数应大于0.99。
5.8 试样溶液的测定
取5.3处理得到的待测溶液进样,内标法计算待测液中目标物质的质量浓度,按第6章计算样品中
待测物的含量。待测样液中的响应值应在标准曲线线性范围内,超过线性范围则应适当减少取样量重新测定。
5.9 空白试验
不称取试样,按5.2和5.3的步骤做空白实验。应确认不含有干扰待测组分的物质。
7 精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。
8 其他
当称取样品5g时,AFTB1的检出限为:0.03μg/kg,AFTB2的检出限为0.03μg/kg,AFTG1的检
出限为0.03μg/kg,AFTG2的检出限为0.03μg/kg;AFTB1的定量限为0.1μg/kg,AFTB2的定量限
为0.1μg/kg,AFTG1的定量限为0.1μg/kg,AFTG2的定量限为0.1μg/kg。
第二法 高效液相色谱-柱前衍生法
9 原理
试样中的黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2,用乙腈-水溶液或甲醇-水
溶液的混合溶液提取,提取液经黄曲霉毒素固相净化柱净化去除脂肪、蛋白质、色素及碳水化合物等干
扰物质,净化液用三氟乙酸柱前衍生,液相色谱分离,荧光检测器检测,外标法定量。
10 试剂和材料
除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的一级水。
10.1 试剂
10.1.1 甲醇(CH3OH):色谱纯。
10.1.2 乙腈(CH3CN):色谱纯。
10.1.3 正己烷(C6H14):色谱纯。
10.1.4 三氟乙酸(CF3COOH)。
10.2 试剂配制
10.2.1 乙腈-水溶液(84+16):取840mL乙腈加入160mL水。
10.2.2 甲醇-水溶液(70+30):取700mL甲醇加入300mL水。
10.2.3 乙腈-水溶液(50+50):取500mL乙腈加入500mL水。
10.2.4 乙腈-甲醇溶液(50+50):取500mL乙腈加入500mL甲醇。
10.3 标准品
10.3.1 AFTB1标准品(C17H12O6,CAS号:1162-65-8):纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证
书的标准物质。
10.3.2 AFTB2标准品(C17H14O6,CAS号:7220-81-7):纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证
书的标准物质。
10.3.3 AFTG1标准品(C17H12O7,CAS号:1165-39-5):纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证
书的标准物质。
10.3.4 AFTG2标准品(C17H14O7,CAS号:7241-98-7):纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证
书的标准物质。
注:标准物质可以使用满足溯源要求的商品化标准溶液。
10.4 标准溶液配制
10.4.1 标准储备溶液(10μg/mL):分别称取 AFTB1、AFTB2、AFTG1和 AFTG21mg(精确至
0.01mg),用乙腈溶解并定容至100mL。此溶液浓度约为10μg/mL。溶液转移至试剂瓶中后,在
-20℃ 下避光保存,备用。临用前进行浓度校准(校准方法参见附录A)。
10.4.2 混合标准工作液(AFTB1和AFTG1:100ng/mL,AFTB2和AFTG2:30ng/mL):准确移取
AFTB1和AFTG1标准储备溶液各1mL,AFTB2和AFTG2标准储备溶液各300μL至100mL容量
瓶中,乙腈定容。密封后避光-20℃下保存,三个月内有效。
10.4.3 标准系列工作溶液:分别准确移取混合标准工作液10μL、50μL、200μL、500μL、1000μL、
2000μL、4000μL至10mL容量瓶中,用初始流动相定容至刻度(含 AFTB1和 AFTG1浓度为
0.1ng/mL、0.5ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL、40.0ng/mL,AFTB2和
AFTG2浓度为0.03ng/mL、0.15ng/mL、0.6ng/mL、1.5ng/mL、3.0ng/mL、6.0ng/mL、12ng/mL
的系列标准溶液)。
11 仪器和设备
11.1 匀浆机。
11.2 高速粉碎机。
11.3 组织捣碎机。
11.4 超声波/涡旋振荡器或摇床。
11.5 天平:感量0.01g和0.00001g。
11.6 涡旋混合器。
11.7 高速均质器:转速6500r/min~24000r/min。
11.8 离心机:转速≥6000r/min。
11.9 玻璃纤维滤纸:快速、高载量、液体中颗粒保留1.6μm。
11.10 氮吹仪。
11.11 液相色谱仪:配荧光检测器。
11.12 色谱分离柱。
11.13 黄曲霉毒素专用型固相萃取净化柱(以下简称净化柱),或相当者。
11.14 一次性微孔滤头:带0.22μm微孔滤膜(所选用滤膜应采用标准溶液检验确认无吸附现象,方可使用)。
11.15 筛网:1mm~2mm试验筛孔径。
11.16 恒温箱。
11.17 pH计。
12 分析步骤
12.1 样品制备
12.1.1 液体样品(植物油、酱油、醋等)
采样量需大于1L,对于袋装、瓶装等包装样品需至少采集3个包装(同一批次或号),将所有液体
样品在一个容器中用匀浆机混匀后,其中任意的100g(mL)样品进行检测。
12.1.2 固体样品(谷物及其制品、坚果及籽类、婴幼儿谷类辅助食品等)
采样量需大于1kg,用高速粉碎机将其粉碎,过筛,使其粒径小于2mm孔径试验筛,混合均匀后缩
分至100g,储存于样品瓶中,密封保存,供检测用。
12.1.3 半流体(腐乳、豆豉等)
采样量需大于1kg(L),对于袋装、瓶装等包装样品需至少采集3个包装(同一批次或号),用组织
捣碎机捣碎混匀后,储存于样品瓶中,密封保存,供检测用。
12.2 样品提取
12.2.1 液体样品
12.2.1.1 植物油脂
称取5g试样(精确至0.01g)于50mL离心管中,加入20mL乙腈-水溶液(84+16)或甲醇-水溶
液(70+30),涡旋混匀,置于超声波/涡旋振荡器或摇床中振荡20min(或用均质器均质3min),在
6000r/min下离心10min,取上清液备用。
12.2.1.2 酱油、醋
称取5g试样(精确至0.01g)于50mL离心管中,用乙腈或甲醇定容至25mL(精确至0.1mL),涡
旋混匀,置于超声波/涡旋振荡器或摇床中振荡20min(或用均质器均质3min),在6000r/min下离心
10min(或均质后玻璃纤维滤纸过滤),取上清液备用。
12.2.2 固体样品
12.2.2.1 一般固体样品
称取5g试样(精确至0.01g)于50mL离心管中,加入20.0mL乙腈-水溶液(84+16)或甲醇-水溶
液(70+30),涡旋混匀,置于超声波/涡旋振荡器或摇床中振荡20min(或用均质器均质3min),在
6000r/min下离心10min(或均质后玻璃纤维滤纸过滤),取上清液备用。
12.2.2.2 婴幼儿配方食品和婴幼儿辅助食品
称取5g试样(精确至0.01g)于50mL离心管中,加入20.0mL乙腈-水溶液(50+50)或甲醇-水溶
液(70+30),涡旋混匀,置于超声波/涡旋振荡器或摇床中振荡20min(或用均质器均质3min),在
6000r/min下离心10min(或均质后玻璃纤维滤纸过滤),取上清液备用。
12.2.3 半流体样品
称取5g试样(精确至0.01g)于50mL离心管中,加入20.0mL乙腈-水溶液(84+16)或甲醇-水溶
液(70+30),置于超声波/涡旋振荡器或摇床中振荡20min(或用均质器均质3min),在6000r/min下
离心10min(或均质后玻璃纤维滤纸过滤),取上清液备用。
12.3 样品黄曲霉毒素固相净化柱净化
......
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