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| 标准编号 | GB 5009.24-2016 (GB5009.24-2016) | | 中文名称 | 食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素M族的测定 | | 英文名称 | National Food Safety Standard -- Determination of M Aflatoxins in Foods | | 行业 | 国家标准 | | 中标分类 | X09 | | 字数估计 | 19,125 | | 发布日期 | 2016-12-23 | | 实施日期 | 2017-06-23 | | 旧标准 (被替代) | GB 5009.24-2010部分; GB 5413.37-2010; GB/T 23212-2008部分; SN/T 1664-2005部分 | | 标准依据 | National Health and Family Planning Commission Notice No.17 of 2016 | | 发布机构 | 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局、中国国家标准化管理委员会 | GB 5009.24-2016: 食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素M族的测定
GB 5009.24-2016 英文名称: National Food Safety Standard -- Determination of M Aflatoxins in Foods
中华人民共和国国家标准
1 范围
本标准规定了食品中黄曲霉毒素 M1和黄曲霉毒素 M2(以下简称 AFT M1和 AFT M2)的测定方法。
第一法为同位素稀释液相色谱-串联质谱法,适用于乳、乳制品和含乳特殊膳食用食品中AFTM1和AFTM2的测定。
第二法为高效液相色谱法,适用范围同第一法。
第三法为酶联免疫吸附筛查法,适用于乳、乳制品和含乳特殊膳食用食品中AFTM1的筛查测定。
第一法 同位素稀释液相色谱-串联质谱法
5 分析步骤
使用不同厂商的免疫亲和柱,在样品的上样、淋洗和洗脱的操作方面可能略有不同,应该按照供应
商所提供的操作说明书要求进行操作。
警示:整个分析操作过程应在指定区域内进行。该区域应避光(直射阳光),具备相对独立的操作台
和废弃物存放装置。在整个实验过程中,操作者应按照接触剧毒物的要求采取相应的保护措施。
5.1 样品提取
5.1.1 液态乳、酸奶
称取4g混合均匀的试样(精确到0.001g)于50mL离心管中,加入100μL13C17-AFTM1内标溶
液(5ng/mL)振荡混匀后静置30min,加入10mL甲醇,涡旋3min。置于4℃、6000r/min下离心
10min或经玻璃纤维滤纸过滤,将适量上清液或滤液转移至烧杯中,加40mL水或PBS稀释,备用。
5.1.2 乳粉、特殊膳食用食品
称取1g样品(精确到0.001g)于50mL离心管中,加入100μL13C17-AFTM1内标溶液(5ng/
mL)振荡混匀后静置30min,加入4mL50℃热水,涡旋混匀。如果乳粉不能完全溶解,将离心管置于
50℃的水浴中,将乳粉完全溶解后取出。待样液冷却至20℃后,加入10mL甲醇,涡旋3min。置于
4℃、6000r/min下离心10min或经玻璃纤维滤纸过滤,将适量上清液或滤液转移至烧杯中,加40mL水或PBS稀释,备用。
5.1.3 奶油
称取1g样品(精确到0.001g)于50mL离心管中,加入100μL13C17-AFTM1内标溶液(5ng/
mL)振荡混匀后静置30min,加入8mL石油醚,待奶油溶解,再加9mL水和11mL甲醇,振荡
30min,将全部液体移至分液漏斗中。加入0.3g氯化钠充分摇动溶解,静置分层后,将下层移到圆底
烧瓶中,旋转蒸发至10mL以下,用PBS稀释至30mL。
5.1.4 奶酪
称取1g已切细、过孔径1mm~2mm圆孔筛混匀样品(精确到0.001g)于50mL离心管中,加
100μL13C17-AFTM1内标溶液(5ng/mL)振荡混匀后静置30min,加入1mL水和18mL甲醇,振荡
30min,置于4℃、6000r/min下离心10min或经玻璃纤维滤纸过滤,将适量上清液或滤液转移至圆
底烧瓶中,旋转蒸发至2mL以下,用PBS稀释至30mL。
5.2 净化
5.2.1 免疫亲和柱的准备将低温下保存的免疫亲和柱恢复至室温。
5.2.2 净化免疫亲和柱内的液体放弃后,将上述样液移至50mL注射器筒中,调节下滴流速为1mL/min~
3mL/min。待样液滴完后,往注射器筒内加入10mL水,以稳定流速淋洗免疫亲和柱。待水滴完后,
用真空泵抽干亲和柱。脱离真空系统,在亲和柱下放置10mL刻度试管,取下50mL的注射器筒,加入
2×2mL乙腈(或甲醇)洗脱亲和柱,控制1mL/min~3mL/min下滴速度,用真空泵抽干亲和柱,收集
全部洗脱液至刻度试管中。在50℃下氮气缓缓地将洗脱液吹至近干,用初始流动相定容至1.0mL,涡
旋30s溶解残留物,0.22μm滤膜过滤,收集滤液于进样瓶中以备进样。
注:全自动(在线)或半自动(离线)的固相萃取仪器可优化操作参数后使用。为防止黄曲霉毒素 M破坏,相关操作
在避光(直射阳光)条件下进行。
5.3 液相色谱参考条件
液相色谱参考条件列出如下:
a) 液相色谱柱:C18柱(柱长100mm,柱内径2.1mm,填料粒径1.7μm),或相当者。
b) 色谱柱柱温:40℃。
c) 流动相:A相,5mmol/L乙酸铵水溶液;B相,乙腈-甲醇(50+50)。梯度洗脱:参见表1。
d) 流速:0.3mL/min。
e) 进样体积:10μL。
5.4 质谱参考条件
质谱参考条件列出如下:
a) 检测方式:多离子反应监测(MRM);
b) 离子源控制条件:参见表2;
c) 离子选择参数:见表3;
d) 液相色谱-质谱图和子离子扫描图:见附录C。
5.5 定性测定
试样中目标化合物色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间相比较,变化范围应在±2.5%之内。
每种化合物的质谱定性离子必须出现,至少应包括一个母离子和两个子离子,而且同一检测批次,
对同一化合物,样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比,其允许偏差
不超过表4规定的范围。
5.6 标准曲线的制作
在5.3、5.4液相色谱-串联质谱仪分析条件下,将标准系列溶液由低到高浓度进样检测,以AFTM1
和AFTM2色谱峰与内标色谱峰13C17-AFTM1的峰面积比值-浓度作图,得到标准曲线回归方程,其线性相关系数应大于0.99。
5.7 试样溶液的测定
取5.2下处理得到的待测溶液进样,内标法计算待测液中目标物质的质量浓度,按第6章计算样品中待测物的含量。
5.8 空白试验
不称取试样,按5.1和5.2的步骤做空白实验。应确认不含有干扰待测组分的物质。
7 精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。
8 其他
称取液态乳、酸奶4g时,本方法AFTM1检出限为0.005μg/kg,AFTM2检出限为0.005μg/kg,
AFTM1定量限为0.015μg/kg,AFTM2定量限为0.015μg/kg。
称取乳粉、特殊膳食用食品、奶油和奶酪1g时,本方法AFTM1检出限为0.02μg/kg,AFTM2检
出限为0.02μg/kg,AFTM1定量限为0.05μg/kg,AFTM2定量限为0.05μg/kg。
第二法 高效液相色谱法
9 原理
试样中的黄曲霉毒素 M1和黄曲霉毒素 M2用甲醇-水溶液提取,上清液稀释后,经免疫亲和柱净化
和富集,净化液浓缩、定容和过滤后经液相色谱分离,荧光检测器检测。外标法定量。
10 试剂和材料
除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的一级水。
10.1 试剂
10.1.1 乙腈(CH3CN):色谱纯。
10.1.2 甲醇(CH3OH):色谱纯。
10.1.3 氯化钠(NaCl)。
10.1.4 磷酸氢二钠(Na2HPO4)。
10.1.5 磷酸二氢钾(KH2PO4)。
10.1.6 氯化钾(KCl)。
10.1.7 盐酸(HCl)。
10.1.8 石油醚(CnH2n+2):沸程为30℃~60℃。
10.2 试剂配制
10.2.1 乙腈-水溶液(25+75):量取250mL乙腈加入750mL水中,混匀。
10.2.2 乙腈-甲醇溶液(50+50):量取500mL乙腈加入500mL甲醇中,混匀。
10.2.3 磷酸盐缓冲溶液(以下简称PBS):称取8.00g氯化钠、1.20g磷酸氢二钠(或2.92g十二水磷
酸氢二钠)、0.20g磷酸二氢钾、0.20g氯化钾,用900mL水溶解后,用盐酸调节pH至7.4,再加水至1000mL。
10.3 标准品
10.3.1 AFTM1标准品(C17H12O7,CAS:6795-23-9):纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
10.3.2 AFTM2标准品(C17H14O7,CAS:6885-57-0):纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
10.4 标准溶液配制
10.4.1 标准储备溶液(10μg/mL):分别称取AFTM1和AFTM21mg(精确至0.01mg),分别用乙腈
溶解并定容至100mL。将溶液转移至棕色试剂瓶中,在-20℃下避光密封保存。临用前进行浓度校准(校准方法参见附录A)。
10.4.2 混合标准储备溶液(1.0μg/mL):分别准确吸取10μg/mLAFT M1和 AFT M2标准储备液
1.00mL于同一10mL容量瓶中,加乙腈稀释至刻度,得到1.0μg/mL的混合标准液。此溶液密封后避光4℃保存,有效期3个月。
10.4.3 100ng/mL混合标准工作液(AFTM1和AFTM2):准确移取混合标准储备溶液(1.0μg/mL)
1.0mL至10mL容量瓶中,加乙腈稀释至刻度。此溶液密封后避光4℃下保存,有效期3个月。
10.4.4 标准系列工作溶液:分别准确移取标准工作液5μL、10μL、50μL、100μL、200μL、500μL至
10mL容量瓶中,用初始流动相定容至刻度,AFTM1和AFTM2的浓度均为0.05ng/mL、0.1ng/mL、
0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL的系列标准溶液。
11 仪器和设备
11.1 天平:感量0.01g、0.001g和0.00001g。
11.2 水浴锅:温控50℃±2℃。
11.3 涡旋混合器。
11.4 超声波清洗器。
11.5 离心机:转速≥6000r/min。
11.6 旋转蒸发仪。
11.7 固相萃取装置(带真空泵)。
11.8 氮吹仪。
11.9 圆孔筛:1mm~2mm孔径。
11.10 液相色谱仪(带荧光检测器)。
11.11 玻璃纤维滤纸:快速、高载量、液体中颗粒保留1.6μm。
11.12 一次性微孔滤头:带0.22μm微孔滤膜。
11.13 免疫亲和柱:柱容量≥100ng。(柱容量、回收率、柱回收率验证方法参见附录B)。
注:对于不同批次的亲和柱在使用前需进行质量验证。
12 分析步骤
使用不同厂商的免疫亲和柱,在样品的上样、淋洗和洗脱的操作方面可能略有不同,应该按照供应
商所提供的操作说明书要求进行操作。
警示:整个分析操作过程应在指定区域内进行。该区域应避光(直射阳光),具备相对独立的操作台
和废弃物存放装置。在整个实验过程中,操作者应按照接触剧毒物的要求采取相应的保护措施。
12.1 试液提取
除不加同位素内标溶液,方法同5.1。
12.2 净化
方法同5.2。
12.3 液相色谱参考条件
液相色谱参考条件列出如下:
a) 液相色谱柱:C18柱(柱长150mm,柱内径4.6mm;填料粒径5μm),或相当者。
b) 柱温:40℃。
c) 流动相:A相,水;B相,乙腈-甲醇(50+50)。等梯度洗脱条件:A,70%;B,30%。
d) 流速;1.0mL/min。
e) 荧光检测波长:发射波长360nm;激发波长430nm。
f) 进样量:50μL。
液相色谱图见附录D。
12.4 测定
12.4.1 标准曲线的制作
将系列标准溶液由低到高浓度依次进样检测,以峰面积-浓度作图,得到标准曲线回归方程。
12.4.2 试样溶液的测定
待测样液中的响应值应在标准曲线线性范围内,超过线性范围的则应稀释后重新进样分析。
12.4.3 空白试验
不称取试样,按12.1和12.2的步骤做空白实验。确认不含有干扰待测组分的物质。
14 精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。
15 其他
称取液态乳、酸奶4g时,本方法AFTM1检出限为0.005μg/kg,AFTM2检出限为0.0025μg/kg,
AFTM1定量限为0.015μg/kg,AFTM2定量限为0.0075μg/kg。
称取乳粉、特殊膳食用食品、奶油和奶酪1g时,本方法AFTM1检出限为0.02μg/kg,AFTM2检
出限为0.01μg/kg,AFTM1定量限为0.05μg/kg,AFTM2定量限为0.025μg/kg。
第三法 酶联免疫吸附筛查法
16 原理
试样中的黄曲霉毒素 M1经均质、冷冻离心、脱脂或有机溶剂萃取等处理获得上清液。利用被辣根
过氧化物酶标记或固定在反应孔中的黄曲霉毒素 M1与样品或标准品中的黄曲霉毒素 M1竞争性结合
特异性抗体。在洗涤后加入相应显色剂显色,经无机酸终止反应,于450nm或630nm波长下检测。
样品中的黄曲霉毒素 M1与吸光度在一定浓度范围内呈反比。
17 试剂和溶剂
配制溶液所需试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的二级水。
按照试剂盒说明书所述,配制所需溶液。
所用商品化的试剂盒需按照附录E所述方法验证合格后方可使用。
18 仪器和设备
18.1 微孔板酶标仪:带450nm与630nm(可选)滤光片。
18.2 天平:最小感量0.01g。
18.3 离心机:转速≥6000r/min。
18.4 旋涡混合器。
19 分析步骤
19.1 样品前处理
19.1.1 液态样品
取约100g待测样品摇匀,将其中10g样品用离心机在6000r/min或更高转速下离心10min。
取下层液体约1g于另一试管内,该溶液可直接测定,或者利用试剂盒提......
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