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GB 5009.89-2016

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基本信息
标准编号 GB 5009.89-2016 (GB5009.89-2016)
中文名称 食品安全国家标准 食品中烟酸和烟酰胺的测定
英文名称 National Food Safety Standard -- Determination of Niacin and Nicotinamide in Foods
行业 国家标准
中标分类 C53
国际标准分类 67.040
字数估计 14,135
发布日期 2016-12-23
实施日期 2017-06-23
旧标准 (被替代) GB 5413.15-2010; GB/T 5009.89-2003; GB/T 9695.25-2008
标准依据 National Health and Family Planning Commission Notice No.17 of 2016
发布机构 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会、国家食品药品监督管理总局
范围 本标准规定了食品中烟酸和烟酰胺的测定方法。本标准第一法为微生物法,适用于各类食品包括以天然食品为基质的强化食品中烟酸和烟酰胺总量的测定;第二法为高效液相色谱法,适用于强化食品中烟酸和烟酰胺的测定。

GB 5009.89-2016: 食品安全国家标准 食品中烟酸和烟酰胺的测定
GB 5009.89-2016 英文名称: National Food Safety Standard -- Determination of Niacin and Nicotinamide in Foods
中华人民共和国国家标准
1 范围
本标准规定了食品中烟酸和烟酰胺的测定方法。
本标准第一法为微生物法,适用于各类食品包括以天然食品为基质的强化食品中烟酸和烟酰胺总
量的测定;第二法为高效液相色谱法,适用于强化食品中烟酸和烟酰胺的测定。
第一法 微生物法
5 分析步骤
5.1 储备菌种的制备将菌种植物乳杆菌Lactobacillμsplantarμm(ATCC8014)转接至乳酸杆菌琼脂培养基中,在36℃
±1℃恒温培养箱中培养20h~24h,取出后放入2℃~4℃冰箱中保存。每月至少传种一次,作为储备菌株保存。
实验前将储备菌株接种至乳酸杆菌琼脂培养基中,在36℃±1℃恒温培养箱中培养20h~24h以
活化菌株,用于接种液的制备。保存数周以上的储备菌种,不能立即用作接种液制备,实验前宜连续传
种2代~3代以保证菌株活力。
5.2 接种液的制备
试验前一天,从乳酸杆菌琼脂培养基移取部分菌种于灭菌的10mL乳酸杆菌肉汤培养基中,于
36℃±1℃恒温培养箱中培养6h~18h。在无菌条件下离心该培养液15min,倾去上清液。加入
10mL已灭菌的生理盐水重新分散细胞,于旋涡混合器上快速混合均匀,离心15min,倾去上清液。重
复离心和清洗步骤三次。以第三次细胞分散液中吸取1mL加入10mL已灭菌的生理盐水,使其充分
混合均匀制成混悬液,备用。用721分光光度计,在550nm波长下,以0.9%生理盐水为参比,读取该
菌悬液的透光值,用0.9%生理盐水或第三次细胞分散液调整透光值,使其范围在60%~80%之间。立即使用。
5.3 试样制备
谷薯类、豆类、坚果(去壳)等试样需粉碎、研磨、过筛(筛板孔径0.3mm~0.5mm);乳粉、米粉等试
样混匀;肉、蛋、鱼、动物内脏等用打碎机制成食糜;果蔬、半固体食品等试样需匀浆混匀;液体试样用前
振摇混合。如不能马上检测,于4℃冰箱保存。
5.4 试样提取
准确称取约烟酸试样,一般乳类、新鲜果蔬试样2g~5g(精确至0.01g);谷类、豆类、坚果类、内
脏、生肉、干制试样0.2g~1g(精确至0.01g),液态试样5g;乳粉、米粉等准确称取适量试样2g(精确
至0.01g);一般营养素补充剂、复合营养强化剂0.1g~0.5g;食品0.2g~1g;液体饮料或流质、半流质
试样5g~10g于100mL锥形瓶中,加入被检验物质干重10倍的硫酸溶液。在121℃下,水解30min
后冷却至室温。用0.1mol/L氢氧化钠溶液调pH至6.0~6.5,再用0.1mol/L盐酸调pH至4.5±0.1,
用水定容至100mL,用无灰滤纸过滤,滤液备用。
5.5 稀释
根据试样中烟酸含量用水对试样提取液进行适当稀释(f),使稀释后试样提取液中烟酸含量在50.0ng~500.0ng范围内。
5.6 测定系列管制备
5.6.1 标准系列管
取试管分别加入烟酸标准工作液0.00mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL、
4.0mL和5.00mL,补水至5.0mL,相当于标准系列管中烟酸含量为0.0ng、50ng、100ng、150ng、
200ng、250ng、300ng、400ng、500ng。加5.0mL烟酸测定用培养基,见表1。混匀。每个标准点应制备3管。
5.6.3 灭菌将所有的标准系列管和试样系列管测定管塞好棉塞,于121℃(0.10MPa~0.12MPa)高压灭菌
5min。灭菌完成后,迅速冷却,备用。
5.7 培养
5.7.1 接种:在无菌操作条件下,将接种液转入无菌滴管,向每支测定管接种一滴。
5.7.2 培养:将加完菌液的试管置于36℃±1℃恒温培养箱中培养16h~24h,直至获得最大浊度,即
再培养2h浊度无明显变化。另准备一支标准0管(含0.0ng烟酸)不接种作为0对照管。
5.8 测定
用厚度为1cm比色杯,在波长550nm条件下读取光密度值,将培养好的测定管用涡旋混匀器混
匀。以未接种0对照管调节透光率为100%,然后依次测定标准系列管、试样系列管的透光率。取出最
高浓度标准曲线管振荡5s,测定光密度值,放回重新培养。2h后同等条件重新测该管的光密度,如果
两次光密度的绝对差结果≤2%,则取出全部检验管测定标准溶液和试样的光密度。
5.9 标准曲线的制作
以标准系列管烟酸含量为横坐标,光密度值为纵坐标,绘制标准曲线,也可对各个标准点做拟合曲
线。各个标准点3管之间的光密度值的相对标准偏差应小于10%,如果某一标准点3支试样管中有
2支烟酸含量落在50ng~500ng范围内,且该两管之间折合为每毫升试样提取液中烟酸含量的偏差小
于10%,则该结果可用,如果3支试样管中烟酸含量的相对标准偏差大于10%,则该点舍去,不参与标准曲线的绘制。
7 精密度
普通食品在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%;强化
食品在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5%。
8 其他
按样品种类将待测试样稀释到线性范围内再对样品进行测试。
本标准试管法线性范围50ng/mL~500ng/mL;天然类等含量较低的食品试样称样量为5g时,
检出限为0.05mg/100g,定量限为0.1mg/100g;强化食品等含量较高的食品试样称样量为1g时,检
出限为0.25mg/100g,定量限为0.5mg/100g。
第二法 高效液相色谱法
9 原理
高蛋白样品经沉淀蛋白质,高淀粉样品经淀粉酶酶解,在弱酸性环境下超声波振荡提取,以C18色
谱柱分离,在紫外检测器检测261nm波长处检测,根据色谱峰的保留时间定性,外标法定量,计算试样
中烟酸和烟酰胺含量。
10 试剂和材料
除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的一级水。
10.1 试剂
10.1.1 盐酸(HCl):优级纯。
10.1.2 氢氧化钠(NaOH):优级纯。
10.1.3 高氯酸(HClO4):体积分数为60%,优级纯。
10.1.4 甲醇(CH3OH):色谱纯。
10.1.5 异丙醇(C3H8O):色谱纯。
10.1.6 庚烷磺酸钠(C7H15NaO3S):色谱纯。
10.1.7 淀粉酶:酶活力≥1.5μ/mg。
10.2 试剂配制
10.2.1 盐酸(5.0mol/L):用量筒量取415mL盐酸,于1000mL烧杯中,加585mL水,混匀。
10.2.2 盐酸(0.1mol/L):用移液管吸取8.3mL盐酸,于1000mL烧杯中,加991.7mL水,混匀。
10.2.3 氢氧化钠(5.0mol/L):称取200g氢氧化钠(3.2.2)于烧杯中加水溶解并转移至1000mL容量瓶中,加水定容,混匀。
10.2.4 氢氧化钠(0.1mol/L):称取4.0g氢氧化钠(3.2.2)于烧杯中加水溶解并转移至1000mL容量瓶中,加水定容,混匀。
10.2.5 流动相:甲醇70mL、异丙醇20mL、庚烷磺酸钠1g,用910mL水溶解并混匀后,用高氯酸调
pH至2.1±0.1,经0.45μm膜过滤。
10.3 烟酸和烟酰胺标准溶液
烟酸(C6H5NO2)和烟酰胺(C6H6N2O):纯度 >99%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
10.3.1 烟酸和烟酰胺标准储备液(1.000mg/mL):准确称取烟酸及烟酰胺标准品各0.05g(精确到
0.1mg),分别置于100mL容量瓶中,用0.1mol/L盐酸溶解,定容至刻度,混匀(4℃冰箱中可保存1个月)。
注:标准储备液配制完以后,需要进行浓度校正,校正方法见附录B。
10.3.2 烟酸和烟酰胺标准混合中间液(100.0μg/mL):准确吸取烟酸和烟酰胺标准储备液(10.3.1)各
10.0mL于100mL容量瓶中,加水定容至刻度,混匀。临用前配制。
10.3.3 烟酸和烟酰胺标准混合工作液:分别准确吸取标准混合中间液(10.3.2)1.0mL、2.0mL、
5.0mL、10.0mL、20.0mL于100mL容量瓶中,加水定容至刻度,混匀,得到浓度分别为1.0μg/mL、
2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL的标准混合工作液。临用前配制。
11 仪器和设备
11.1 天平:感量0.1mg。
11.2 恒箱培养箱:30℃~80℃。
11.3 超声波振荡器。
11.4 pH计:精度±0.01。
11.5 高效液相色谱仪:带紫外检测器。
11.6 一次性微孔滤头:带0.45μm微孔滤膜。
12 分析步骤
12.1 试样制备与处理
非粉状固态试样粉碎并混合均匀;液态试样摇匀。
12.1.1 淀粉类和含淀粉的食品(即食谷物、面包、饼干、面条、小麦粉和杂粮粉等制品)
称取混合均匀固体试样约5.0g(精确到0.01g),加入约25mL45℃~50℃的水,称取混合均匀液
体试样约20.0g(精确到0.01g)于150mL锥形瓶中,加入约0.5g淀粉酶,摇匀后向锥形瓶中充氮,盖
上塞,置于50℃~60℃的培养箱内培养约30min,取出冷却至室温。
注:如果条件允许,建议酶解时采用55℃±5℃水浴振摇。
12.1.2 不含淀粉的食品(调制乳、调制乳粉、饮料类、固体饮料类、豆粉和豆浆粉等制品)
称取混合均匀固体试样约5.0g(精确到0.01g),加入约25mL45℃~50℃的水,称取混合均匀液
体试样约20.0g(精确到0.01g)于150mL锥形瓶中,置于超声波振荡器中振荡约10min以上充分溶
解,静置5min~10min,并冷却至室温。
12.1.3 提取
待试样溶液降至室温后,用5.0mol/L盐酸溶液和0.1mol/L盐酸溶液调节试样溶液的pH 至
1.7±0.1,放置约2min后,再用5.0mol/L氢氧化钠溶液和0.1mol/L氢氧化钠溶液调节试样溶液的
pH至4.5±0.1,置于50℃水浴超声波振荡器中振荡10min以上充分提取,冷却至室温后转至100mL
容量瓶中,用水反复冲洗锥形瓶,洗液合并于100mL容量瓶中,用水定容至刻度后混匀,经滤纸过滤。
滤液再经0.45μm微孔滤膜加压过滤,用样品瓶收集,即为试样测定液。
注:必要时,试样测定液用水进行适当的稀释(f),使试样测定液中烟酸和烟酰胺浓度在1μg/mL~20μg/mL范围内。
12.2 参考液相色谱条件
参考液相色谱条件列出如下:
a) 色谱柱:C18(粒径5μm,250mm×4.6mm)或具有同等性能的色谱柱;
b) 柱温:25℃±0.5℃;
c) 紫外检测器:检测波长为261nm;
d) 流动相:甲醇70mL、异丙醇20mL、庚烷磺酸钠1g,用910mL水溶解并混匀后,用高氯酸调
pH至2.1±0.1,经0.45μm膜过滤;
e) 流速:1.0mL/min;
f) 进样量:10μL或20μL。
12.3 测定
12.3.1 标准曲......
   
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