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| 标准编号 | GB/T 15670.3-2017 (GB/T15670.3-2017) | | 中文名称 | 农药登记毒理学试验方法 第3部分：急性经口毒性试验 序贯法 | | 英文名称 | Toxicological test methods for pesticides registration - Part 3: Acute oral toxicity test - Up-and-down-procedure | | 行业 | 国家标准 (推荐) | | 中标分类 | B17 | | 国际标准分类 | 65.100 | | 字数估计 | 9,926 | | 发布日期 | 2017-07-12 | | 实施日期 | 2018-02-01 | | 引用标准 | GB 14925 | | 发布机构 | 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局、中国国家标准化管理委员会 | | 范围 | GB/T 15670的本部分规定了急性经口毒性试验序贯法的基本原则、方法和要求。本部分适用于为农药登记而进行的急性经口毒性试验。 | GB/T 15670.3-2017: 农药登记毒理学试验方法 第3部分：急性经口毒性试验 序贯法
中华人民共和国国家标准
农药登记毒理学试验方法
第3部分:急性经口毒性试验 序贯法
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局
中国国家标准化管理委员会发布
前言
GB/T 15670《农药登记毒理学试验方法》分为以下部分:
---第1部分:总则;
---第2部分:急性经口毒性试验 霍恩氏法;
---第3部分:急性经口毒性试验 序贯法;
---第4部分:急性经口毒性试验 概率单位法;
---第5部分:急性经皮毒性试验;
---第6部分:急性吸入毒性试验;
---第7部分:皮肤刺激性/腐蚀性试验;
---第8部分:急性眼刺激性/腐蚀性试验;
---第9部分:皮肤变态反应(致敏)试验;
---第10部分:短期重复经口染毒(28天)毒性试验;
---第11部分:短期重复经皮染毒(28天)毒性试验;
---第12部分:短期重复吸入染毒(28天)毒性试验;
---第13部分:亚慢性毒性试验;
---第14部分:细菌回复突变试验;
---第15部分:体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验;
---第16部分:体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验;
---第17部分:哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验;
---第18部分:啮齿类动物显性致死试验;
---第19部分:体外哺乳动物细胞染色体畸变试验;
---第20部分:体外哺乳动物细胞基因突变试验;
---第21部分:体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成(UDS)试验;
---第22部分:体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验;
---第23部分:致畸试验;
---第24部分:两代繁殖毒性试验;
---第25部分:急性迟发性神经毒性试验;
---第26部分:慢性毒性试验;
---第27部分:致癌试验;
---第28部分:慢性毒性与致癌合并试验;
---第29部分:代谢和毒物动力学试验。
本部分为GB/T 15670的第3部分。
本部分按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。
本部分由中华人民共和国农业部提出并归口。
本部分起草单位:农业部农药检定所。
本部分主要起草人:贺锡雯、张丽英、曲甍甍、陶传江。
农药登记毒理学试验方法
第3部分:急性经口毒性试验 序贯法
1 范围
GB/T 15670的本部分规定了急性经口毒性试验 序贯法的基本原则、方法和要求。
本部分适用于为农药登记而进行的急性经口毒性试验。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 14925 实验动物 环境及设施
农药登记资料规定(中华人民共和国农业部令〔2007〕第10号)
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
急性经口毒性 acuteoraltoxicity
一次或在24h内多次经口给予实验动物受试物后,动物在短期内出现的健康损害效应。
3.2
剂量 dose
所给受试物的量,以实验动物单位体重所接受受试物的质量表示(mg/kg体重)。
3.3
半数致死剂量 medianlethaldose
LD50
一次或在24h内多次给予实验动物受试物后,引起实验动物总体中半数死亡的毒物统计学剂量。
以实验动物单位体重接受受试物的质量表示(mg/kg体重)。
3.4
剂量-反应关系 dose-responserelationship
剂量与特定效应的发生率间的关系。
4 试验目的
急性经口毒性试验是评估受试物毒性的第一步。通过短时间经口染毒初步了解受试物的毒性特征
和剂量-反应关系,为急性毒性分级、标签管理和其他毒理学试验剂量选择提供依据。
5 试验概述
序贯法(up-and-down-procedure,UDP)是一个阶梯式的染毒程序。使用单一性别的动物,一次染
毒一只。第一只动物的染毒剂量最好低于LD50的估计值。后续动物染毒剂量的增减,取决于前一只动
物的染毒结果(存活或死亡);在不能获得受试物LD50的初步估计值及剂量-反应曲线斜率资料时,计算
机摸拟结果提示起始剂量可选择175mg/kg体重,采用0.5的反对数(对应于一个默认的剂量级数因子
3.2)计算剂量间距。以最大似然法计算LD50的点估计值和95%可信区间。
注:剂量级数因子由剂量-反应曲线斜率的倒数的反对数决定(3.2是斜率为2时的级数因子)。
正式试验使用的动物数大约6只~9只。限量试验不超过5只。本方法仅适用于动物染毒后
1d~2d内死亡的受试物,对预期染毒后死亡延迟至5d以上(含5d)的受试物不适用。
6 试验方法
6.1 受试物
受试物可配制成水溶液、油溶液或悬浮液。尽可能选用水或食用油(如玉米油)作溶剂,其他如羧甲
基纤维素钠、明胶和淀粉可将受试物配制成混悬液或糊剂。除水以外的溶剂,用前应了解其毒理学特
性,必要时设立溶剂对照组。染毒时,不同浓度受试物现用现配。一次染毒容量不超过1mL/100g体
重,水溶液可达到2mL/100g体重,通过调整受试物溶液的浓度,使各剂量组经口染毒的容量一致。如
一次染毒容量太大,可在24h内分2次~3次给予。
6.2 实验动物
6.2.1 种属和性别
啮齿类动物中可选用SD大鼠或 Wistar大鼠。单一性别,通常采用雌性动物(应为未妊娠和未经
产的),比较敏感。如有相关结构的化学物的毒理学、代谢和毒物动力学研究证明雄性大鼠更敏感,可选
择后者。
6.2.2 年龄和体重
健康成年大鼠鼠龄在8周~10周内。动物体重变异不超过动物平均体重的±20%。按随机原则
逐只进入试验。
6.3 饲养环境和条件
动物饲养环境和条件应符合GB 14925的有关规定。喂饲常规动物饲料,饮水量不限。试验前,入
选动物在饲养环境中至少检疫、适应3d。
6.4 试验步骤
6.4.1 限量试验
6.4.1.1 受试物的一次染毒剂量为5000mg/kg体重。先给一只动物染毒,在染毒48h内动物存活,
再给2只动物相同的剂量,观察14d,如动物依然存活可终止试验或在给相同剂量的2只动物中,1只
存活1只死亡,再追加2只动物,染毒的5只动物有大于或等于3只动物存活,可结束试验,表明该受试
物的LD50 >5000mg/kg体重。
6.4.1.2 上述5只染毒动物中有3只动物分别在48h内死亡或死亡时间延迟在14d观察期内,终止染
毒,进入正式试验。
6.4.2 正式试验
6.4.2.1 试验前,大鼠禁食过夜,饮水不限。
6.4.2.2 起始剂量和剂量级数因子的选择。在无法得到受试物致死剂量的估计值时,默认的起始剂量
为175mg/kg体重。对应于剂量-反应斜率为2的级数因子3.2所设定的剂量序列为:1.75mg/kg体
重,5.5mg/kg体重,17.5mg/kg体重,55mg/kg体重,175mg/kg体重,555mg/kg体重和2000mg/kg
体重或1.75mg/kg体重,5.5mg/kg体重,17.5mg/kg体重,55mg/kg体重,175mg/kg体重,555mg/kg
体重,1750mg/kg体重和5000mg/kg体重。如已知受试物的剂量-反应曲线斜率比较陡峭或较平坦,
剂量级数因子可以缩小或加大。附录A列出了起始剂量为175mg/kg体重,斜率在1~8的剂量级数
可供选择。
6.4.2.3 试验开始,称量禁食后动物的体重,使用灌胃针头经口染毒,一次一只动物,每只动物的染毒间
隔时间为48h。第二只动物染毒剂量取决于第一只动物的染毒结果,如动物死亡或呈濒死状态,剂量
按级数因子下调一级;如动物存活,剂量上调一级。当后续剂量出现与起始剂量相反的染毒结果时,再
追加4只动物序贯染毒后结束试验,或当达到任一终止试验的规定(见6.4.2.6)时,可结束试验。染毒
后大鼠应继续禁食3h~4h。对每只动物的观察期为14d。
6.4.2.4 如染毒48h内动物存活,而在后续观察期内出现延迟死亡,表明剂量选择不合适,可考虑再给
2只动物低于引起死亡的剂量,重新开始试验,延长观察期。
6.4.2.5 试验结果以最大似然法(见附录B)计算该受试物的LD50和95%可信区间。
6.4.2.6 符合下述任一条件即可结束试验:
a) 在上限剂量范围的序贯染毒中有3只动物存活时;
b) 在任取的6只序贯染毒动物中出现5次相反结果时;
c) 在第一次出现相反结果后至少有4只动物序贯染毒,从第一次相反结果后,开始计算每一个剂
量的似然值,其给定的似然比超过临界值。
LD50和斜率的变异大,在出现相反结果后有4只~6只动物序贯染毒即符合终止试验的规定。在
有些情况下,受试物的剂量-反应曲线斜率平坦,可能需要追加动物达到15只。
6.5 试验观察和检查
6.5.1 临床观察
在染毒后24h(特别在染毒后30min内和第一个4h)以及14d的观察期内,每天定时观察并详细
记录每只动物的中毒反应。临床观察至少包括:
a) 中枢神经系统和神经肌肉系统:体位异常、叫声异常、不安、呆滞、震颤、抽搐、麻痹、运动失调、
对外反应过敏或迟钝,异常行为如过度反复抓挠口周、梳理、转圈,甚至自残、倒退行走等;
b) 植物神经系统:瞳孔扩大或缩小、流涎和流泪;
c) 呼吸系统:鼻孔流液、鼻衄、鼻翼扇动、呼吸深缓、呼吸过速、蜂腰;
d) 泌尿生殖系统:会阴部污秽、有分泌物、阴道或乳房肿胀;
e) 皮肤和被毛:皮肤充血、紫绀、被毛蓬松或潮湿、污秽;
f) 眼:眼球突出、结膜充血、溢血性分泌物、角膜浑浊;
g) 消化系统:腹泻、厌食。
记录出现震颤、抽搐、流涎、腹泻、嗜睡和昏迷的时间、严重程度,死亡时间或恢复时间。濒临死亡和
剧烈痛苦的动物以及试验结束尚存活的动物,最终应给予人道处死。
6.5.2 体重称量
应分别在染毒前、染毒后(至少每周一次)和处死前称量并记录动物体重。
6.5.3 病理学检查
在试验期内中毒死亡的和人道处死的动物应做大体解剖,记录每只动物的大体病理改变。染毒后
存活时间大于或等于24h的动物其器官显示有大体病理改变,则需进行组织病理学检查,以便获取有
关毒作用的信息。
7 试验结果和评价
7.1 结果统计
7.1.1 最大似然比应用软件包(AOT425StatPgm)可直接计算正式试验LD50的点估计值和95%可信
区间。
7.1.2 将试验数据以表格形式列出,包括染毒剂量序列、使用动物数、每只动物的中毒表现、中毒表现
出现时间、死亡动物数和时间、恢复时间以及大体解剖检查结果。
7.1.3 软件包将根据上述表格列出的内容自动完成统计分析过程。
7.2 结果评价
LD50值是受试物毒性分级和标签标识的依据。急性经口毒性级别按照《农药登记资料规定》中
3.3.2.8的相应标准判定。
评价试验结果时,应考虑LD50与观察到的毒性效应(包括行为和临床改变、大体损伤、体重变化、致
死效应及其他毒性作用)的发生率和严重程度之间的关系。引用LD50值时一定要注明所用实验动物的
种属、性别、染毒途径和观察期限等。
8 试验报告
试验报告至少应包括以下内容:
a) 试验名称、试验单位名称和联系方式、报告编号;
b) 试验委托单位和联系方式、样品受理日期和封样情况;
c) 试验开始和结束日期、试验项目负责人、试验单位技术负责人、签发日期;
d) 试验摘要;
e) 受试物名称、有效成分美国化学文摘登录号(CAS号)(如已知)、代码(如有)、纯度(或含量)、
剂型、生产日期(批号)、......
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