路径: 主页 > GB/T > 第581页 > GB/T 22388-2008 | 标准编号 | GB/T 22388-2008 (GB/T22388-2008) | | 中文名称 | 原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法 | | 英文名称 | Determination of melamine in raw milk and dairy products | | 行业 | 国家标准 (推荐) | | 中标分类 | C53 | | 国际标准分类 | 67.100 | | 字数估计 | 14,123 | | 发布日期 | 2008-10-07 | | 实施日期 | 2008-10-07 | | 引用标准 | GB/T 6682 | | 发布机构 | 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局、中国国家标准化管理委员会 | | 范围 | 本标准规定了原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的三种测定方法, 即高效液相色谱法、液相色谱-质谱/质谱法和气相色谱-质谱联用法。本标准适用于原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的定量测定;液相色谱-质谱/质谱法、气相色谱-质谱联用法同时适用于原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的定性确证。本标准高效液相色谱法的定量限为2㎎/㎏, 液相色谱-质谱/质谱法的定量限为0.01㎎/㎏, 气相色谱-质谱法的定量限为0.05㎎/㎏。 | GB/T 22388-2008: 原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法
GB/T 22388-2008 英文名称: Determination of melamine in raw milk and dairy products
ICS ６７．１００
C５３
中华人民共和国国家标准
１ 范围
本标准规定了原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的三种测定方法，即高效液相色谱法
（ＨＰＬＣ法）、液相色谱-质谱／质谱法（ＬＣ-ＭＳ／ＭＳ法）和气相色谱-质谱联用法［包括气相色谱-质谱法
（ＧＣ-ＭＳ法），气相色谱-质谱／质谱法（ＧＣ-ＭＳ／ＭＳ法）］。
本标准适用于原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的定量测定；液相色谱-质谱／质谱法、气相
色谱-质谱联用法（包括气相色谱-质谱／质谱法）同时适用于原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的定性确证。
本标准高效液相色谱法的定量限为２ｍｇ／ｋｇ，液相色谱-质谱／质谱法的定量限为０．０１ｍｇ／ｋｇ，气
相色谱-质谱法的定量限为０．０５ｍｇ／ｋｇ（其中气相色谱-质谱／质谱法的定量限为０．００５ｍｇ／ｋｇ）。
２ 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有
的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究
是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/T ６６８２ 分析实验室用水规格和试验方法
３ 第一法 高效液相色谱法（HPLC法）
３．１ 原理
试样用三氯乙酸溶液-乙腈提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用高效液相色谱测定，外标法定量。
３．２ 试剂与材料除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T ６６８２规定的一级水。
３．２．１ 甲醇：色谱纯。
３．２．２ 乙腈：色谱纯。
３．２．３ 氨水：含量为２５％～２８％。
３．２．４ 三氯乙酸。
３．２．５ 柠檬酸。
３．２．６ 辛烷磺酸钠：色谱纯。
３．２．７ 甲醇水溶液：准确量取５０ｍＬ甲醇和５０ｍＬ水，混匀后备用。
３．２．８ 三氯乙酸溶液（１％）：准确称取１０ｇ三氯乙酸于１Ｌ容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混匀后备用。
３．２．９ 氨化甲醇溶液（５％）：准确量取５ｍＬ氨水和９５ｍＬ甲醇，混匀后备用。
３．２．１０ 离子对试剂缓冲液：准确称取２．１０ｇ柠檬酸和２．１６ｇ辛烷磺酸钠，加入约９８０ｍＬ水溶解，调
节ｐＨ至３．０后，定容至１Ｌ备用。
３．２．１１ 三聚氰胺标准品：ＣＡＳ１０８-７８-０１，纯度大于９９．０％。
３．２．１２ 三聚氰胺标准储备液：准确称取１００ｍｇ（精确到０．１ｍｇ）三聚氰胺标准品于１００ｍＬ容量瓶
中，用甲醇水溶液（３．２．７）溶解并定容至刻度，配制成浓度为１ｍｇ／ｍＬ的标准储备液，于４℃避光保存。
３．２．１３ 阳离子交换固相萃取柱：混合型阳离子交换固相萃取柱，基质为苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯
基苯高聚物，填料质量为６０ｍｇ，体积为３ｍＬ，或相当者。使用前依次用３ｍＬ甲醇、５ｍＬ水活化。
３．２．１４ 定性滤纸。
３．２．１５ 海砂：化学纯，粒度０．６５ｍｍ～０．８５ｍｍ，二氧化硅（ＳｉＯ２）含量为９９％。
３．２．１６ 微孔滤膜：０．２μｍ，有机相。
３．２．１７ 氮气：纯度大于等于９９．９９９％。
３．３ 仪器和设备
３．３．１ 高效液相色谱（ＨＰＬＣ）仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器。
３．３．２ 分析天平：感量为０．０００１ｇ和０．０１ｇ。
３．３．３ 离心机：转速不低于４０００ｒ／ｍｉｎ。
３．３．４ 超声波水浴。
３．３．５ 固相萃取装置。
３．３．６ 氮气吹干仪。
３．３．７ 涡旋混合器。
３．３．８ 具塞塑料离心管：５０ｍＬ。
３．３．９ 研钵。
３．４ 样品处理
３．４．１ 提取
３．４．１．１ 液态奶、奶粉、酸奶、冰淇淋和奶糖等
称取２ｇ（精确至０．０１ｇ）试样于５０ｍＬ具塞塑料离心管中，加入１５ｍＬ三氯乙酸溶液（３．２．８）和
５ｍＬ乙腈，超声提取１０ｍｉｎ，再振荡提取１０ｍｉｎ后，以不低于４０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ。上清液经三氯
乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，用三氯乙酸溶液定容至２５ｍＬ，移取５ｍＬ滤液，加入５ｍＬ水混匀后做待净化液。
３．４．１．２ 奶酪、奶油和巧克力等称取２ｇ（精确至０．０１ｇ）试样于研钵中，加入适量海砂（试样质量的４倍～６倍）研磨成
干粉状，转移至５０ｍＬ具塞塑料离心管中，用１５ｍＬ三氯乙酸溶液（３．２．８）分数次清洗研钵，清洗液转入离心管
中，再往离心管中加入５ｍＬ乙腈，余下操作同３．４．１．１中“超声提取１０ｍｉｎ，加入５ｍＬ水混匀后做待净化液”。
注：若样品中脂肪含量较高，可以用三氯乙酸溶液饱和的正己烷液-液分配除脂后再用ＳＰＥ柱净化。
３．４．２ 净化
将３．４．１中的待净化液转移至固相萃取柱（３．２．１３）中。依次用３ｍＬ水和３ｍＬ甲醇洗涤，抽至近
干后，用６ｍＬ氨化甲醇溶液（３．２．９）洗脱。整个固相萃取过程流速不超过１ｍＬ／ｍｉｎ。洗脱液于５０℃
下用氮气吹干，残留物（相当于０．４ｇ样品）用１ｍＬ流动相定容，涡旋混合１ｍｉｎ，过微孔滤膜（３．２．１６）
后，供 ＨＰＬＣ测定。
３．５ 高效液相色谱测定
３．５．１ HPLC参考条件
ａ） 色谱柱：Ｃ８ 柱，２５０ｍｍ×４．６ｍｍ［内径（ｉ．ｄ．）］，５μｍ，或相当者。
Ｃ１８柱，２５０ｍｍ×４．６ｍｍ［内径（ｉ．ｄ．）］，５μｍ，或相当者。
ｂ） 流动相：Ｃ８ 柱，离子对试剂缓冲液（３．２．１０）-乙腈（８５＋１５，体积比），混匀。
Ｃ１８柱，离子对试剂缓冲液（３．２．１０）-乙腈（９０＋１０，体积比），混匀。
ｃ） 流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ。
ｄ） 柱温：４０℃。
ｅ） 波长：２４０ｎｍ。
ｆ） 进样量：２０μＬ。
３．５．２ 标准曲线的绘制
用流动相将三聚氰胺标准储备液逐级稀释得到的浓度为０．８、２、２０、４０、８０μｇ／ｍＬ的标准工作液，
浓度由低到高进样检测，以峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程。基质匹配加标三聚氰胺的样品
ＨＰＬＣ色谱图参见附录 Ａ中的图 Ａ．１。
３．５．３ 定量测定待测样液中三聚氰胺的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进样分析。
３．５．４ 结果计算试样中三聚氰胺的含量由色谱数据处理软件或按式（１）计算获得：
３．６ 空白实验除不称取样品外，均按上述测定条件和步骤进行。
３．７ 方法定量限本方法的定量限为２ｍｇ／ｋｇ。
３．８ 回收率在添加浓度２ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ浓度范围内，回收率在８０％～１１０％之间，相对标准偏差小于１０％。
３．９ 允许差在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的１０％。
４ 第二法 液相色谱-质谱／质谱法（LC-MS／MS法）
４．１ 原理试样用三氯乙酸溶液提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用液相色谱-质谱／质谱法测定和确证，外标法定量。
４．２ 试剂与材料除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T ６６８２规定的一级水。
４．２．１ 乙酸。
４．２．２ 乙酸铵。
４．２．３ 乙酸铵溶液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）：准确称取０．７７２ｇ乙酸铵于１Ｌ容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混匀后备用。
４．２．４ 其他同３．２。
４．３ 仪器和设备
４．３．１ 液相色谱-质谱／质谱（ＬＣ-ＭＳ／ＭＳ）仪：配有电喷雾离子源（ＥＳＩ）。
４．３．２ 其他同３．３。
４．４ 样品处理
４．４．１ 提取
４．４．１．１ 液态奶、奶粉、酸奶、冰淇淋和奶糖等称取１ｇ（精确至０．０１ｇ）试样于５０ｍＬ具塞塑料离心管中，加入８ｍＬ三氯乙酸溶液（３．２．８）和
２ｍＬ乙腈，超声提取１０ｍｉｎ，再振荡提取１０ｍｉｎ后，以不低于４０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ。上清液经三氯
乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，做待净化液。
４．４．１．２ 奶酪、奶油和巧克力等
称取１ｇ（精确至０．０１ｇ）试样于研钵中，加入适量海砂（试样质量的４倍～６倍）研磨成干粉状，转
移至５０ｍＬ具塞塑料离心管中，加入８ｍＬ三氯乙酸溶液（３．２．８）分数次清洗研钵，清洗液转入离心管
中，再加入２ｍＬ乙腈，余下操作同４．４．１．１中“超声提取１０ｍｉｎ，做待净化液”。
注：若样品中脂肪含量较高，可以用三氯乙酸溶液饱和的正己烷液-液分配除脂后再用ＳＰＥ柱净化。
４．４．２ 净化将４．４．１中的待净化液转移至固相萃取柱（３．２．１３）中。依次用３ｍＬ水和３ｍＬ甲醇洗涤，抽至近
干后，用６ｍＬ氨化甲醇溶液（３．２．９）洗脱。整个固相萃取过程流速不超过１ｍＬ／ｍｉｎ。洗脱液于５０℃
下用氮气吹干，残留物（相当于１ｇ试样）用１ｍＬ流动相定容，涡旋混合１ｍｉｎ，过微孔滤膜（３．２．１６）后，供ＬＣ-ＭＳ／ＭＳ测定。
４．５ 液相色谱-质谱／质谱测定
４．５．１ LC参考条件
４．５．２ MS／MS参考条件
４．５．３ 标准曲线的绘制
取空白样品按照４．４处理。用所得的样品溶液将三聚氰胺标准储备液（３．２．１２）逐级稀释得到的浓
度为０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．５μｇ／ｍＬ的标准工作液，浓度由低到高进样检测，以定量子离子峰面积-浓
度作图，得到标准曲线回归方程。基质匹配加标三聚氰胺的样品 ＬＣ-ＭＳ／ＭＳ多反应监测质量色谱图
参见附录 Ａ中的图 Ａ．２。
４．５．４ 定量测定
待测样液中三聚氰胺的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进样分析。
４．５．５ 定性判定
按照上述条件测定试样和标准工作溶液，如果试样中的质量色谱峰保留时间与标准工作溶液一致
（变化范围在±２．５％之内）；样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰
度一致，相对丰度偏差不超过表１的规定，则可判断样品中存在三聚氰胺。
４．５．６ 结果计算同３．５．４。
４．６ 空白实验除不称取样品外，均按上述测定条件和步骤进行。
４．７ 方法定量限本方法的定量限为０．０１ｍｇ／ｋｇ。
４．８ 回收率在添加浓度０．０１ｍｇ／ｋｇ～０．５ｍｇ／ｋｇ浓度范围内，回收率在８０％～１１０％之间，相对标准偏差小于１０％。
４．９ 允许差在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的１５％。
５ 第三法 气相色谱-质谱联用法（GC-MS和GC-MS／MS法）
５．１ 原理
试样经超声提取、固相萃取净化后，进行硅烷化衍生，衍生产物采用选择离子监测质谱扫描模式
（ＳＩＭ）或多反应监测质谱扫描模式（ＭＲＭ），用化合物的保留时间和质谱碎片的丰度比定性，外标法定量。
５．２ 试剂与材料除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T ６６８２规定的一级水。
５．３ 仪器和设备
５．３．１ 气相色谱-质谱（ＧＣ-ＭＳ）仪：配有电子轰击电离离子源（ＥＩ）。
５．３．２ 气相色谱-质谱／质谱（ＧＣ-ＭＳ／ＭＳ）仪：配有电子轰击电离离子源（ＥＩ）。
５．３．３ 电子恒温箱。
５．３．４ 其他同３．３。
５．４ 样品处理
５．４．１ GC-MS法
５．４．１．１ 提取
５．４．１．１．１ 液态奶、奶粉、酸奶和奶糖等称取５ｇ（精确至０．０１ｇ）样品于５０ｍＬ具塞比色管，加入２５ｍＬ三氯乙酸溶液（３．２．８），涡旋振荡
３０ｓ，再加入１５ｍＬ三氯乙酸溶液，超声提取１５ｍｉｎ，加入２ｍＬ乙酸铅溶液（５．２．４），用三氯乙酸溶液
定容至刻度。充分混匀后，转移上层提取液约３０ｍＬ至５０ｍＬ离心试管，以不低于４０００ｒ／ｍｉｎ离心
１０ｍｉｎ。上清液待净化。
５．４．１．１．２ 奶酪、奶油和巧克力等
称取５ｇ（精确至０．０１ｇ）样品于５０ｍＬ具塞比色管中，用５ｍＬ热水溶解（必要时可适当加热），再
加入２０ｍＬ三氯乙酸溶液（３．２．８），涡旋振荡３０ｓ，再加入１５ｍＬ三氯乙酸溶液超声提取及以下操作同
５．４．１．１．１。若样品中脂肪含量较高，可以先用乙醚脱脂后再用三氯乙酸溶液提取。
５．４．１．２ 净化准确移取５ｍＬ的待净化滤液至固相萃取柱（３．２．１３）中。再用３ｍＬ水、３ｍＬ甲醇淋洗，弃淋洗
液，抽近干后用３ｍＬ氨化甲醇溶液（３．２．９）洗脱，收集洗脱液，５０℃下氮气吹干。
５．４．２ GC-MS／MS法
５．４．２．１ 奶粉、奶酪、奶油、巧克力和奶糖等
称取０．５ｇ（精确至０．０１ｇ）试样，加入５ｍＬ甲醇水溶液（３．２．７），涡旋混匀２ｍｉｎ后，超声提取
１５ｍｉｎ～２０ｍｉｎ，以不低于４０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液２００μＬ
用微孔滤膜（３．２．１６）过滤，５０℃下氮气吹干。
５．４．２．２ 液态奶和酸奶等
称取１ｇ（精确至０．０１ｇ）试样，加入５ｍＬ甲醇，涡旋混匀２ｍｉｎ后，超声提取及以下操作同５．４．２．１。
５．４．３ 衍生化取上述氮气吹干残留物，加入６００μＬ的吡啶和２００μＬ衍生化试剂（５．２．３），混匀，７０℃反应
３０ｍｉｎ后，供ＧＣ-ＭＳ或ＧＣ-ＭＳ／ＭＳ法定量检测或确证。
５．５ 气相色谱-质谱测定
５．５．１ 仪器参考条件
５．５．１．１ GC-MS参考条件
ａ） 色谱柱：５％苯基二甲基聚硅氧烷石英毛细管柱，３０ｍ×０．２５ｍｍ［内径（ｉ．ｄ．）］×０．２５μｍ，或相当者。
ｂ） 流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ。
ｃ） 程序升温：７０℃保持１ｍｉｎ，以１０℃／ｍｉｎ的速率升温至２００℃，保持１０ｍｉｎ。
ｄ） 传输线温度：２８０℃。
ｅ） 进样口温度：２５０℃。
ｆ） 进样方式：不分流进样。
ｇ） 进样量：１μＬ。
ｈ） 电离方式：电子轰击电离（ＥＩ）。
ｉ） 电离能量：７０ｅＶ。
ｊ） 离子源温度：２３０℃。
ｋ） 扫描模式：选择离子扫描，定性离子ｍ／ｚ９９、１７１、３２７、３４２，定量离子ｍ／ｚ３２７。
５．５．１．２ GC-MS／MS参考条件
ａ） 色谱柱：５％苯基二甲基聚硅氧烷石英毛细管柱，３０ｍ×０．２５ｍｍ［内径（ｉ．ｄ．）］×０．２５μｍ，或相当者。
ｂ） 流速：１．......
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