路径: 主页 > GB/T > 第673页 > GB/T 34796-2017 | 标准编号 | GB/T 34796-2017 (GB/T34796-2017) | | 中文名称 | 水溶液中核酸的浓度和纯度检测 紫外分光光度法 | | 英文名称 | Quantification and purity analysis of nucleic acid concentration in solution -- Ultraviolet spectrophotometry | | 行业 | 国家标准 (推荐) | | 中标分类 | A40 | | 国际标准分类 | 07.080 | | 字数估计 | 9,910 | | 发布日期 | 2017-11-01 | | 实施日期 | 2018-05-01 | | 标准依据 | 国家标准公告2017年第29号 | | 发布机构 | 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局、中国国家标准化管理委员会 | GB/T 34796-2017: 水溶液中核酸的浓度和纯度检测 紫外分光光度法
ICS 07.080
A40
中华人民共和国国家标准
水溶液中核酸的浓度和纯度
检测 紫外分光光度法
2017-11-01发布
2018-05-01实施
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局
中国国家标准化管理委员会发布
前言
本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。
本标准由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC387)提出并归口。
本标准起草单位:中国测试技术研究院生物研究所、上海市计量测试技术研究院、中国测试技术研
究院、四川中测生物科技有限公司。
本标准主要起草人:谭和平、周李华、许丽、刘刚、马丽侠、李妍、叶德萍、梁文、王智、丁敏、孙登峰。
水溶液中核酸的浓度和纯度
检测 紫外分光光度法
1 范围
本标准规定了使用紫外分光光度法检测水溶液中核酸的浓度和纯度的原理、样品制备及检测方法。
本标准适用于水溶液中核酸的浓度和纯度检测,可对浓度在5ng/μL及以上的水溶液核酸样品定
量检测和纯度分析。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 11165 实验室pH计
GB/T 26813 双光束紫外可见分光光度计
JJG646 移液器检定规程
3 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
RNA:核糖核酸(ribonucleicacid)
4 原理
核酸中嘌呤和嘧啶碱基有共轭双键,具有吸收紫外光的性质,其最大吸收值在波长为250nm ~
270nm 之间。碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后其最大吸收峰不会改变,最大吸收波长约260nm,吸收
低峰在230nm。在波长260nm 处,1单位OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50μg/mL、单链
DNA及 RNA为40μg/mL、单链寡核苷酸为33μg/mL,利用此量和浓度关系,可用于计算核酸样品
的浓度。
5 试剂和材料
除非另有规定,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的一级水。
5.1 DNA标准溶液
小牛胸腺DNA标准溶液。
5.2 三羟甲基氨基甲烷缓冲液(1mol/LTris-HCl,pH7.4)
称取121.1gTris置于1L烧杯中,加入800mL去离子水,充分搅拌溶解,用 NaOH 调节pH值,
定容至1L,分装后在103kPa(1.05kg/cm2)高压蒸汽灭菌20min,室温保存,备用。
5.3 EDTA(500mmol/L,pH8.0)
称取186.1gNa2EDTA·2H2O,置于1L烧杯中,加入约800mL的去离子水,充分搅拌,用
NaOH调节pH 至8.0(pH 至8.0时,EDTA 才能完全溶解),定容至1L,分装后在103kPa
(1.05kg/cm2)高压蒸汽灭菌20min,室温保存,备用。
5.4 TE缓冲液(10×TEBuffer,pH7.4)
量取100mL1mol/LTris-HCl(pH7.4),20mL500mmol/LEDTA(pH8.0)置于1L烧杯中,
加入800mL去离子水,混合均匀,定容至1L,分装后在103kPa(1.05kg/cm2)高压蒸汽灭菌20min,
室温保存,备用。
6 主要仪器、设备
6.1 紫外分光光度计或核酸蛋白测定仪,应符合GB/T 26813的要求。
6.2 漩涡器。
6.3 电子天平:精度分别为0.1mg、0.01mg。
6.4 pH计,0.1级,应符合 GB/T 11165的要求。
6.5 可调移液器:0.5μL~10μL、10μL~100μL、100μL~1000μL,应符合JJG646的要求。
7 样品制备
将适量核酸样品溶解于无菌水或TE溶液中,稀释至工作曲线范围内供测定。
8 吸光度检测核酸浓度和纯度
8.1 仪器设置条件和程序
8.1.1 核酸浓度检测
检测波长:260nm。
8.1.2 核酸纯度检测
检测波长:260nm、230nm、280nm。
8.2 测定
取适量核酸溶液(溶液体积根据仪器要求)检测,以稀释溶液调零,根据波长260nm、230nm、
280nm处核酸的吸光度,计算DNA双链、DNA单链和RNA的浓度,根据 OD 260/OD 280和 OD 260/
OD230比值判断核酸纯度。重复测定3次取平均值。核苷三磷酸的特性参见表A.1及纯化的DNA的
分光光度测定结果参见表B.1。
8.3 结果计算
8.3.1 核酸浓度检测结果计算
核酸浓度按照以下公式计算:
a) 核酸样品摩尔浓度含量按式(1)计算:
c=
ε×b
(1)
式中:
c---样品浓度,单位为摩尔每升(mol/L);
A---吸光度;
ε---波长依赖的摩尔消光系数,单位为升每摩尔厘米[L/(mol·cm)];
b---光程,单位为厘米(cm)。
b) 样品的质量浓度按式(2)计算:
ρ=OD260×B (2)
式中:
ρ ---样品浓度,单位为克每升(g/L);
OD260---光程为1cm时在260nm波长下的吸光度值,单位为每厘米(cm-1);
B ---平均消光系数[(μg/mL)-1·cm-1]。
注:对于大分子核酸来说,其浓度计算时可采用平均消光系数。对于较小的寡核苷酸,可根据式(3)由碱基组成精
确计算出摩尔消光系数,再根据式(2)计算寡核苷酸浓度。
E =A(15.3)+G(11.9)+C(7.4)+T(9.3) (3)
式中:
E ---毫摩尔消光系数(寡核苷酸的浓度一般以 mmol/L表示);
A、G、C、T---寡核苷酸序列中每个核苷酸的个数。
8.3.2 核酸纯度检测结果判断
样品纯度根据式(4)、式(5)计算,按照表1进行判断:
X=
OD260
OD280
(4)
Y=
OD260
(5)
表1 吸光度法检测核酸纯度结果判断表
样品类型
检测结果
X 值 Y 值
DNA样品
纯 DNA 理 论 值 为
1.8
大 于 2.0,表 明 有
RNA污染
小于1.6,表明有蛋
白质污染
小于2表明有酚盐、硫氰酸盐或
其他有机化合物污染
RNA样品
纯 RNA 理 论 值 为
2.0
大于2.0,表明有异
硫氰酸残存
小于1.7,表明有蛋
白质污染
小于2表明有酚盐、硫氰酸盐或
其他有机化合物污染
9 扫描吸收光谱检测核酸浓度和纯度
9.1 仪器设置条件和程序
检测波长:220nm~340nm范围内全波长扫描,并设置报告260nm值、280nm值、OD260/OD280、
OD260/OD230比值。
9.2 测定
9.2.1 仪器调零
取适量稀释溶液(溶液体积量根据仪器要求而定),在220nm~340nm范围内扫描,调仪器基线
(调零)。
9.2.2 样品检测
取适量核酸溶液或标准溶液(溶液体积量根据仪器要求)检测,显示吸收光谱图,读取260nm值、
280nm值、OD260/OD280、OD260/OD230比值,重复测定3次取平均值。较纯的核酸紫外吸收光谱扫描图
参见图C.1。
9.3 结果计算
9.3.1 核酸浓度检测结果计算
仪器自动读取。
9.3.2 核酸纯度检测结果计算
按9.2.2中OD260/OD280、OD260/OD230及结合表1判断纯度。
附 录 A
(资料性附录)
核苷三磷酸的特性
核苷三磷酸的特性见表A.1。
表A.1 核苷三磷酸的特性
核苷三磷酸 λmax(pH7.0) λmin(pH7.0)
εmax×10-3
(pH7.0)
280/260吸收比
(pH7.0)
碱基的pKa值
ATP 259 227 15.4 0.15 4.0
CTP 271 249 12.8 0.97 4.8
GTP 252 223 13.7 0.66 3.3
UTP 262 230 10.0 0.38 9.5
dATP 259 226 15.4 0.15 3.6
dCTP 280 - 13.1 0.98 4.3
dGTP 253 222 13.7 0.66 3.5
dTTP 267 - 9.6 0.73 9.3
附 录 B
(资料性附录)
纯化的DNA的分光光度测定结果
纯化的DNA的分光光度测定结果见表B.1。
表B.1 纯化的DNA的分光光度测定结果a
波长/nm 吸光度 OD260/OD2......
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