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| 标准编号 | GB/T 38505-2020 (GB/T38505-2020) | | 中文名称 | 转基因产品通用检测方法 | | 英文名称 | General detection methods of genetically modified products | | 行业 | 国家标准 (推荐) | | 中标分类 | A40 | | 国际标准分类 | 07.080 | | 字数估计 | 14,146 | | 发布日期 | 2020-03-06 | | 实施日期 | 2020-03-06 | | 引用标准 | GB/T 6682; GB/T 19495.1; GB/T 19495.3; GB/T 19495.7 | | 发布机构 | 国家市场监督管理总局、中国国家标准化管理委员会 | | 范围 | 本标准规定了转基因产品的定性检测方法。本标准适用于水稻、玉米、大豆、油菜、马铃薯、甜菜、苜蓿等及其加工产品中转基因成分的实时荧光PCR通用检测。本标准方法的最低检出限为0.1%(质量分数)。 | GB/T 38505-2020
General detection methods of genetically modified products
ICS 07.080
A40
中华人民共和国国家标准
转基因产品通用检测方法
2020-03-06发布
2020-03-06实施
国 家 市 场 监 督 管 理 总 局
国 家 标 准 化 管 理 委 员 会 发 布
前言
本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。
本标准由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC387)提出并归口。
本标准起草单位:中国检验检疫科学研究院、深圳市易瑞生物技术股份有限公司、辽宁出入境检验
检疫局检验检疫技术中心、甘肃中商食品质量检验检测有限公司、广西出入境检验检疫局检验检疫技术
中心、吉林省农业科学院、上海市计量测试技术研究院、甘肃省商业科技研究所有限公司。
本标准主要起草人:付伟、王晨光、朱鹏宇、杜智欣、魏霜、朱海、洪霞、郑秋月、付辉、何海宁、李飞武、
金虹、安小苹、朱水芳、马涛、刘刚、杨光瑞、曹际娟、袁顺捷、黄文胜。
转基因产品通用检测方法
1 范围
本标准规定了转基因产品的定性检测方法。
本标准适用于水稻、玉米、大豆、油菜、马铃薯、甜菜、苜蓿等及其加工产品中转基因成分的实时荧光
PCR通用检测。
本标准方法的最低检出限为0.1%(质量分数)。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 19495.1 转基因产品检测 通用要求和定义
GB/T 19495.3 转基因产品检测 核酸提取纯化方法
GB/T 19495.7 转基因产品检测 抽样和制样方法
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
18SrRNA基因 18SrRNAgene
转录自18SrDNA,细胞核糖体的组分之一,作为植物内源基因。
3.2
3.3
3.4
来自胭脂碱合成酶基因的终止子。
3.5
基因的3'端终止序列。
3.6
acetyltransderase,PAT)。
注:pat基因对除草剂草甘膦(glufosinate)具有耐受性。
3.7
3.8
smalsubunit1A,RbcS4)编码基因的启动子。
3.9
DAS40278转化体外源插入片断5'端与玉米基因组的连接区序列。
注:该序列包括外源插入片段的部分载体序列和玉米基因组的部分序列。
3.10
DP305423转化体外源插入片断3'端与大豆基因组的连接区序列。
注:该序列包括外源插入片段的部分载体序列和大豆基因组的部分序列。
3.11
CV127转化体外源插入片断5'端与大豆基因组的连接区序列。
注:该序列包括外源插入片段的部分载体序列和大豆基因组的部分序列。
3.12
Ct值 cyclethreshold
反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。
4 试剂与材料
除另有规定外,所有试剂均为分析纯或生化试剂。试验用水符合GB/T 6682中一级水的规格。
4.1 实时荧光PCR预混液
采用经验证符合实时荧光PCR要求的实时荧光PCR预混液。
4.2 500mmol/L乙二胺四乙酸二钠溶液(pH8.0)
称取18.6g乙二胺四乙酸二钠,加入70mL水中,并用 NaOH 溶液调pH 值至8.0,加水定容至
100mL。在103.4kPa(121℃)条件下灭菌20min。
4.3 1mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐溶液(pH8.0)
称取121.1g三羟甲基氨基甲烷溶解于800mL水中,用盐酸调pH值至8.0,加水定容至1000mL。
在103.4kPa(121℃)条件下灭菌20min。
4.4 TE缓冲液(pH8.0)
分别量取10mL1mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐溶液(4.3)和2mL500mmol/L乙二胺四乙酸二
钠溶液(4.2),加水定容至1000mL。在103.4kPa(121℃)条件下灭菌20min。
6.2 制样
按照GB/T 19495.1和GB/T 19495.7的规定执行。
6.3 试样预处理
按照GB/T 19495.1和GB/T 19495.3的规定执行。
6.4 DNA模板制备
按照GB/T 19495.1和GB/T 19495.3的规定执行。或可采用具有相同效果的植物基因组DNA提
取试剂盒进行DNA模板制备。
6.5 DNA浓度测定
采用紫外分光光度法测定DNA浓度,将DNA溶液做适当的稀释,于260nm处测定其吸光度,根
据测定的OD值计算DNA浓度(260nm处1OD=50μg/mL双链DNA),OD值应该在0.2~0.8的范
围内。于280nm处测定其吸光度,根据测定的OD值计算DNA溶液的OD260nm/OD280nm比值,比值应
在1.8~2.0。
6.6 实时荧光PCR检测
6.6.1 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置
以非转基因样品为阴性对照,以对应的转基因植物样品品系或含有相应外源基因的转基因植物样
品基因组DNA,或含有上述片段的质粒标准分子DNA为阳性对照,以水或TE缓冲液为空白对照。
6.6.2 实时荧光PCR反应体系
PCR反应体系见表3或按照经验证符合要求的试剂盒推荐体系进行配制。每个DNA样品做2个
平行管。加样时应使样品DNA溶液完全加入反应液中,不要黏附于管壁上,加样后应尽快盖紧管盖。
6.6.3 仪器设置
设置PCR反应管荧光信号收集条件,应与探针标记的报告基团一致。具体设置方法可参照仪器使
用说明书。
6.6.4 PCR反应参数
实时荧光PCR扩增反应参数:50℃/2min;95℃/10min;95℃/15s,60℃/60s,大于或等于
40个循环。
注:95℃/10min专门适用于化学变构的热启动Taq酶。以上参数可根据不同型号实时荧光PCR仪和所选PCR
扩增试剂体系不同做调整。
6.6.5 PCR反应运行
将PCR反应管依次摆放至实时荧光PCR仪上(上机前注意检查各反应管是否盖紧,以免荧光物质
泄漏污染仪器),开始运行仪器进行实时荧光PCR反应。
7 结果分析
7.1 阈值设定
实时荧光PCR反应结束后,设置荧光信号阈值,阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整,以阈值
线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
7.2 质量控制
空白对照:内参基因检测未出现典型扩增曲线,所有外源基因检测未出现典型扩增曲线,或Ct值大
于或等于40。
阴性对照:内参基因检测出现典型扩增曲线,且Ct值小于或等于30,所有外源基因检测未出现典
型扩增曲线,或Ct值大于或等于40。
阳性对照:内参基因检测出现典型扩增曲线,且Ct值小于或等于30,所有外源基因检测出现典型
扩增曲线,且Ct值小于或等于34。
8 结果判定与表述
8.1 结果判定
测试样品全部平行反应外源基因检测未出现典型扩增曲线,或Ct值大于或等于40;内源基因检测
出现典型扩增曲线,且Ct值小于或等于30,则可判定该样品不含所检的外源基因。
测试样品全部平行反应外源基因检测出现典型扩增曲线,Ct值小于或等于36,内源基因检测出现
典型扩增曲线,Ct值小于或等于30,判定该样品含有对应的外源基因。
测试样品全部平行反应外源基因检测出现典型扩增曲线,但Ct值在36~40之间,内源基因检测
Ct值出现典型扩增曲线,且小于或等于30,应在排除污染的情况下重新处理样品上机检测。再次扩增
后的内源基因检测出现典型扩增曲线,且Ct值小于或等于30,外源基因检测出现典型扩增曲线,且Ct
值仍小于40......
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