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| 标准编号 | GB/T 38568-2020 (GB/T38568-2020) | | 中文名称 | 工业微生物菌株生长表型测定 微液滴浊度法 | | 英文名称 | Determination of growth phenotype for industrial microbial strain -- Microdroplet turbidity | | 行业 | 国家标准 (推荐) | | 中标分类 | A21 | | 国际标准分类 | 07.080 | | 字数估计 | 5,534 | | 发布日期 | 2020-03-31 | | 实施日期 | 2020-03-31 | | 引用标准 | GB/T 6682; GB/T 14926.43 | | 起草单位 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所、中国标准化研究院 | | 归口单位 | 中国标准化研究院 | | 提出机构 | 中国标准化研究院 | | 发布机构 | 国家市场监督管理总局、国家标准化管理委员会 | | 范围 | 本标准规定了用微液滴浊度法测定工业微生物菌株生长表型的方法。本标准适用于工业发酵用细菌、真菌和微藻菌株生长表型测定。 | GB/T 38568-2020: 工业微生物菌株生长表型测定 微液滴浊度法
GB/T 38568-2020 英文名称: Determination of growth phenotype for industrial microbial strain -- Microdroplet turbidity
1 范围
本标准规定了用微液滴浊度法测定工业微生物菌株生长表型的方法。
本标准适用于工业发酵用细菌、真菌和微藻菌株生长表型测定。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 14926.43 实验动物 细菌学检测 染色法、培养基和试剂
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
参考菌株
发酵性能明确,用于发酵生产的经过鉴定的保存菌株。
4 原理
通过微流控芯片产生单细胞包裹液滴,并培养,根据液滴中的菌体面积,进行生长速率的计算。
5 试剂或材料
除非另有规定,所用试剂均为分析纯。
5.1 水
符合GB/T 6682规定的二级水。
5.2 基础培养基
按GB/T 14926.43给出的方法配制。或选用商品化的预制培养基,严格按照商品说明书加水
配制。
5.3 PBS缓冲液,pH7.4
称取磷酸二氢钾(KH2PO4)0.27g、磷酸氢二钠(Na2HPO4)1.42g、氯化钠(NaCl)8g、氯化钾
(KCl)0.2g,将上述各成分加去离子水约800mL充分搅拌溶解,然后加入浓盐酸调pH至7.4,最后定
容到1L。
5.4 超低融点琼脂糖
凝胶点为8℃~17℃。
5.5 氟碳油。
含有表面活性剂。
6 仪器设备
6.1 恒温箱:±1℃。
6.2 离心机:500g~4000g。
6.3 倒置显微镜:带成像模块。
6.4 聚四氟乙烯导管:内径0.5mm。
6.5 PDMS微流控芯片:高度为100μm,后面连接有至少50个培养腔室结构,每个腔室尺寸为1.5mm
×1mm。油相两侧线性结构相同,每一侧长为29.2mm,宽度为40μm;水相的线性结构长为
4.54mm,宽度为60μm。
6.6 分光光度计。
6.7 热板。
7 测定步骤
7.1 菌株活化
7.1.1 按GB/T 14926.43给出的方法配制工业微生物相应的固体平板和液体培养基,用无菌接种环分别蘸取参考菌株和待评价菌株保种菌液,在固体平板上划线,根据生产工艺参数选择相应的温度和pH值,进行培养,直至长出单菌落;分别挑取3个参考菌株和3个待评价菌株单菌落,接种至含有5mL液体培养基的试管中,根据生产工艺参数选择相应的温度和转速,培养至对数期。
7.1.2 从活化的平板培养皿挑取微生物菌株单克隆于5mL液体培养基的容器中,根据生产工艺参数
选择相应的温度和转速,培养至稳定期,去除上清后加入PBS溶液,重复清洗3次。
7.2 微生物菌液浓度选取
用基础培养基稀释得到细胞悬液浓度约为6×105CFU/mL。
7.3 琼脂糖溶液制备
用分析天平称取0.02g超低熔点琼脂糖置于无菌EP管中,并向其中加入1mL已灭菌的基础培养
基,加热溶解,配制成2%(质量浓度)的溶液。趁热用0.22μm的无菌滤头过滤,现用现配。
7.4 单细胞液滴发生
7.4.1 各取500μL微生物菌液和琼脂糖溶液等体积混匀。
7.4.2 取一块芯片,分别在芯片的油相入口加入200μL氟碳油和水相入口加入100μL低熔点琼脂糖
菌液,将注射器与芯片出口相连。
7.4.3 将芯片放在热板上(温度稳定性±1℃,范围在30℃~37℃),将注射器的活塞固定在2mL刻
度处,通过注射器内的负压使液体进入芯片,开始发生液滴。液滴发生需要2min左右。
7.4.4 取另一块芯片重复上述步骤,一为待鉴定菌株,另一为参考菌株。此步骤重复三次。
7.5 单细胞液滴培养
液滴发生结束后,移除芯片上的枪头和聚四氟乙烯管,将两芯片放入4℃冰箱凝固20min后再置
入盛有水的培养皿中于37℃恒温箱进行培养6h。
7.6 芯片成像
将芯片置于倒置显微镜,在10×物镜下进行成像,获取至少20个图片,不少于2000个液滴,并保
存为bmp格式。
7.7 数据处理
用软件进行图片处理,统计每张图片内液滴的个数以及每个液滴的直径,并计算图片中菌斑的平......
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