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| 标准编号 | GB/T 38792-2020 (GB/T38792-2020) | | 中文名称 | 蛋白质致敏性细胞学评价技术规范 | | 英文名称 | Technical specification for cytological evaluation of protein allergenicity | | 行业 | 国家标准 (推荐) | | 中标分类 | A21 | | 国际标准分类 | 07.080 | | 字数估计 | 7,724 | | 发布日期 | 2020-04-28 | | 实施日期 | 2020-11-01 | | 起草单位 | 中国标准化研究院、江南大学、北京萨姆伯科技有限公司、石家庄君乐宝乳业有限公司 | | 归口单位 | 中国标准化研究院 | | 提出机构 | 中国标准化研究院 | | 发布机构 | 国家市场监督管理总局、国家标准化管理委员会 | GB/T 38792-2020
Technical specification for cytological evaluation of protein allergenicity
ICS 07.080
A21
中华人民共和国国家标准
蛋白质致敏性细胞学评价技术规范
2020-04-28发布
2020-11-01实施
国 家 市 场 监 督 管 理 总 局
国 家 标 准 化 管 理 委 员 会 发 布
前言
本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。
本标准由中国标准化研究院提出并归口。
本标准起草单位:中国标准化研究院、江南大学、北京萨姆伯科技有限公司、石家庄君乐宝乳业有限
公司。
本标准主要起草人:马爱进、吴晓玲、胥传来、匡华、袁爱梦、刘丽强、马伟、徐丽广、王忠兴、郝帅、
柴艳兵、张耀广。
蛋白质致敏性细胞学评价技术规范
1 范围
本标准规定了蛋白质致敏性细胞学评价要求、证实方法。
本标准适用于由免疫球蛋白E(IgE)介导的食品蛋白质致敏性的细胞学评价。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
蛋白质致敏性 proteinalergenicity
由蛋白质诱发机体发生过敏反应的特性。
注:本标准中的蛋白质致敏性特指由嗜碱性粒细胞(RBL-2H3)表面结合的IgE与蛋白质相互作用后导致β-氨基己
糖苷酶释放的程度。
4 要求
4.1 按照相关法律法规和标准要求对样品进行接收、保管、交接、配制、回收、退还/销毁处理,并制定相
应的管理制度和程序。
4.2 实验室应符合生物安全一级要求。细胞实验工作区一般要由准备室、缓冲间、无菌室、细胞保存室
组成。其中,缓冲间面积应不小于3m2,并设有更衣柜和紫外灯,紫外灯的强度为不少于1.5W/m3。
紫外灯源距地面不应超过2.5m,每次照射时间为20min~30min。无菌室无菌等级的最低标准应达
到万级。
4.3 评价使用的仪器与设备种类、数量、性能、量程、精度应能满足评价的需要。评价需要的器皿材料
应经过无菌处理,试验操作过程均为无菌操作。
4.4 实验用水应满足GB/T 6682的要求,所使试剂使用前都需经无菌处理。
4.5 评价实验结束后,实验材料应进行无害化处理。
4.6 蛋白质致敏性评价结果以β-氨基己糖苷酶最大释放率表示。
4.7 评价结果应表述出评价蛋白的名称、纯度、使用浓度、β-氨基己糖苷酶最大释放率。
5 证实方法
5.1 β-氨基己糖苷酶释放率测定
5.1.1 样品前处理
5.1.1.1 固体样品
5.1.1.1.1 植物性样品
将待测样品粉碎、450μm 微孔滤膜过滤后,准确称取5.00g于聚丙烯离心管中,向离心管中加入
40mL水,充分振荡混匀。将离心管水平置于振荡器中,室温下100次/min,振荡12h,5000r/min离
心10min,小心吸取上清液于另一个干净的聚丙烯离心管中,真空冷冻干燥,固体蛋白粉末可于2℃~
8℃ 贮存,时间不超过24h。
5.1.1.1.2 动物性样品
将待测样品搅碎匀浆后,准确称取5.00g,置于漏斗中,加入50mL石油醚进行连续3次冲洗后,放
入烘箱中烘干。将烘干后的样品置于聚丙烯离心管中,向离心管中加入10mL15%三氯乙酸溶液(体
积分数),充分振荡混匀,静置10min。样品溶液5000r/min离心10min,小心吸取上清液于另一个干
净的聚丙烯离心管中,真空冷冻干燥,固体蛋白粉末可于2℃~8℃ 贮存,时间不超过24h。
5.1.1.2 液体或半液体样品
称取5.00g液体样品,置于漏斗中,加入50mL石油醚进行连续3次冲洗后,放入烘箱中烘干。将
烘干后的样品置于聚丙烯离心管中,加入40mL水,充分振荡混匀匀,将离心管水平置于振荡器中,室
温下100次/min,振荡过夜12h,5000r/min离心10min,小心吸取上清液于另一个干净的聚丙烯离
心管中,真空冷冻干燥,固体蛋白粉末可于2℃~8℃ 贮存,时间不超过24h。
5.1.2 样品溶液制备
称取上述蛋白样品50.0mg,用PBS缓冲液(参见附录A)溶解并定容至50mL容量瓶中,配制成
质量浓度为1mg/mL的储备溶液。试验时用Tyrode's液(参见附录A)稀释成一定浓度的工作液,现
用现配。
5.1.3 细胞培养
将RBL-2H3细胞(参见附录A)置于细胞培养瓶中,加入10mL的细胞培养液(参见附录A),于
37℃,5% 二氧化碳细胞培养箱中培养48h~72h,倒置显微镜下观察细胞生长情况。当细胞生长至培
养瓶的80%~90%时,进行细胞计数和细胞接种。
5.1.4 细胞接种
将细胞培养液从细胞培养瓶内吸出,用PBS缓冲液洗细胞一次。向细胞培养瓶内加入2.0mL胰
蛋白酶溶液(参见附录A),于37℃消化2min~4min。在倒置显微镜下观察细胞消化情况,当细胞变
圆接近脱壁时,将胰蛋白酶溶液倒掉。加入10mL细胞培养液,用吸管吹打,使细胞脱壁制成细胞悬
液。吸取细胞悬液,以200μL/孔加到细胞培养板中,使细胞接种密度为1×105 细胞/mL。37℃,5%
二氧化碳细胞培养箱中培养24h使其贴壁。
5.1.5 细胞活化
将细胞培养液从细胞培养板内吸出,用PBS缓冲液洗细胞三次。以200μL/孔向细胞培养板内加
入含50μg/mLIgE(参见附录A)的细胞培养液,37℃,5% 二氧化碳细胞培养箱中继续培养24h。
5.1.6 细胞与蛋白的激发作用
5.1.6.1 样品组
将细胞培养液从细胞培养板内吸出,用PBS缓冲液洗细胞三次。分别以50μL/孔向细胞培养板内
加入不同浓度的待测蛋白工作液,37℃,5%二氧化碳细胞培养箱中反应45min。反应结束后,放入冰
水中终止反应。上述各项均设3个复孔。
5.1.6.2 全部释放组
将细胞培养液从细胞培养板内吸出,用PBS缓冲液洗细胞三次。以50μL/孔向细胞培养板内加入
细胞裂解液(参见附录A),轻轻吹打使裂解液和RBL-2H3细胞充分接触,4℃反应45min后,吸取全
部细胞培养上清,1200r/min离心5min,收集细胞上清液。上述设3个复孔。
5.1.6.3 空白对照组
将细胞培养液从细胞培养板内吸出,用PBS缓冲液洗细胞三次。以50μL/孔向细胞培养板内加入
Tyrode's液,37℃,5%二氧化碳细胞培养箱中反应45min。反应结束后,放入冰水中终止反应。上述
设3个复孔。
5.1.7 测定
吸取5.1.6中作用后的反应液,以30μL/孔转移至新的细胞培养板中,以50μL/孔向细胞培养板内
加入PNP-NAG溶液(参见附录A),37℃ 反应1h后,以200μL/孔加入碳酸钠终止液(参见附录A)终
止反应,用酶标仪在波长405nm处测各孔吸光度值。样品组的吸光度标记为A1,空白对照组的吸光
度标记为A0,全部释放组标记为Am。
5.2 β-氨基己糖苷酶释放率结果计算
β-氨基己糖苷酶释放率按式(1)计算:
R=
(A1-A0)
(Am-A0)×
100% (1)
式中:
R ---β-氨基己糖苷酶释放率;
A1 ---样品组的吸光度;
A0 ---空白对照组的吸光度;
Am---全部释放组的吸光度。
平行样的平均值为最终释放率值,计算结果保留到小数点后两位。
附 录 A
(资料性附录)
溶 液 配 制
A.1 水
GB/T 6682规定的二级水。
A.2 0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)
称取7.90g氯化钠、1.44g磷酸氢二钠、1.80g磷酸二氢钾、0.20g氯化钾,用980mL水溶解,用盐
酸调节pH至7.2,再加水定容至1000mL,0.22μm微孔滤膜滤过除菌,4℃保存备用或选用同类商品
化产品。
A.3 0.001mol/L对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷溶液(PNP-NAG溶液)
称取34.2mgPNP-NAG,加水溶解并定容至100mL,0.22μm微孔滤膜滤过除菌,4℃保存备用。
A.4 0.1mol/L碳酸钠终止液
称取1.06g碳酸钠,加水溶解并定容至100mL,0.22μm微孔滤膜滤过除菌,4℃保存备用。
A.5 台氏液(Tyrode's液)
称取7.90g氯化钠、0.20g氯化钾、0.26g七水硫酸镁、0.07g二水磷酸二氢钠、1.00g碳酸氢钠、
0.20g氯化钙和1.00g葡萄糖,用980mL水溶解,用盐酸调节pH至7.2,再加水定容至1000mL,
0.22μm微孔滤膜滤过除菌,4℃保存备用或选用同类商品化产品。
A.6 细胞培养液
素,配制成含体积分数为10%小牛血清、1%青霉素-链霉素的细胞培养液,其中青霉素和链霉素的终浓
度分别是1......
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