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[PDF] GB 4789.31-2013 - 英文版

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GB 4789.31-2013	英文版	459	GB 4789.31-2013	[PDF]天数 >=4	食品安全国家标准　食品微生物学检验沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的肠杆菌科噬菌体诊断检验	有效

基本信息
标准编号	GB 4789.31-2013 (GB4789.31-2013)
中文名称	食品安全国家标准　食品微生物学检验沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的肠杆菌科噬菌体诊断检验
英文名称	National Food Safety Standard Food Microbiological Examination -- Determination and testing of Enterobacteriaceae phage of Salmonella, Shigella and Diarrheagenic Escherichia coli
行业	国家标准
中标分类	C53
国际标准分类	07.100.30
字数估计	20,241
旧标准 (被替代)	GB 4789.31-2003
标准依据	国家卫计委公告2013年第7号
发布机构	中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会
范围	本标准规定了应用肠杆菌科噬菌体诊断方法检验食品中沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌。本标准适用于各类食品和食源性疾病事件样品中沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的检验。本标准适用于食品行业从业人员肠道沙门氏菌和志贺氏菌带菌检验。

GB 4789.31-2013: 食品安全国家标准　食品微生物学检验沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的肠杆菌科噬菌体诊断检验 GB 4789.31-2013 英文名称: National Food Safety Standard Food Microbiological Examination -- Determination and testing of Enterobacteriaceae phage of Salmonella, Shigella and Diarrheagenic Escherichia coli 中华人民共和国国家标准食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的肠杆菌科噬菌体诊断检验 1 范围本标准规定了应用肠杆菌科噬菌体诊断方法检验食品中沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌。本标准适用于各类食品和食源性疾病事件样品中沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的检验。本标准适用于食品行业从业人员肠道沙门氏菌和志贺氏菌带菌检验。 5 操作步骤 5.1 前增菌、增菌和分离 5.1.1 沙门氏菌的前增菌、增菌和分离按 GB 4789.4 进行。沙门氏菌增菌液灵敏度的测定见附录 B。在食品行业从业人员的肠道沙门氏菌带菌检验时，采集的标本应增菌，不应前增菌。食物中毒标本不应前增菌，所采集的标本同时做增菌和不增菌步骤。 5.1.2 志贺氏菌的增菌和分离按GB 4789.5进行。没有厌氧培养条件的实验室可以采用附录A中的BCT 增菌液。食物中毒患者的粪便标本同时做增菌和不增菌步骤。 5.1.3 致泻大肠埃希氏菌的增菌和分离按 GB 4789.6 和 GB 4789.36 进行。食物中毒标本同时做增菌和不增菌步骤。 5.2 噬菌体试验 5.2.1 培养基的准备营养琼脂平板（含琼脂 1%~1.5%，为防止变形杆菌的蔓延生长，可按 0.02%量加入十二烷基硫酸钠），营养琼脂加热溶化后，加入每个 9 cm 平皿中约 20 mL~25 mL，放在水平台面上待其凝固。翻转平板，在 36 ℃1 ℃培养箱内半开皿倒置约 1 h，或 50 ℃1 ℃培养箱内半开皿倒置约 30 min，以烘干培养基表面水分。 5.2.2 试验菌液的准备 5.2.2.1 自选择性琼脂平板上分别挑取 2 个以上典型或可疑菌落，检验沙门氏菌时，挑取乳糖阴性产 H2S 或不产 H2S 的菌落，和乳糖阳性产 H2S 的菌落。检验大肠埃希氏菌时挑取乳糖阳性或乳糖阴性的菌落。检验志贺氏菌时挑取典型或可疑菌落分别接种 TSI、半固体和营养琼脂斜面各一管，置 36 ℃1 ℃ 培养 20 h～24 h 后选取三糖铁底层产酸、斜面产碱，不产 H2S，不产气无动力的菌落。下述两种方法可供制备试验菌液时选用。 5.2.2.2 方法一：将待检菌落接种于营养肉汤管内，于 36 ℃1 ℃培养 14 h~24 h。挑取此肉汤培养物 1 满环（约 5 L），稀释于盛有 1 mL~2 mL 的营养肉汤管内，使成为 1:200~1:400 稀释菌液，含菌量约为1×106 CFU/mL。 5.2.2.3 方法二：用接种针在鉴别平板上挑取可疑菌落，稀释于盛有 1mL~2 mL 营养肉汤管内，含菌量约为 1×106 CFU/mL。 5.2.3 涂抹试验菌液 5.2.3.1 斑点涂抹法：将营养琼脂表面自圆心起分为三等分或二等分，每等分可供涂抹 1 株细菌培养物。每挑取试验菌液 1 满环，涂抹直径约 1 cm 的菌斑一个。每株培养物涂抹菌斑 7 个，外圈 5 个，内圈 2个。 5.2.3.2 棉签涂抹法：用无菌棉签蘸取试验菌液并略挤去过多液体，在如上琼脂平板表面三分之一的区域内涂抹。三个涂抹区之间保持适当距离，待菌液干燥。 5.2.4 滴加噬菌体用定量为 1 mL 的一次性注射器（针头无编号，1 mL 约有 100~200 滴，每滴相当于 5 L~10 L），在每一个菌斑上滴加噬菌体。或用定量为 10 L 或 5 L 的微量移液器在每一个菌斑上滴加噬菌体一滴，每滴加一种噬菌体应更换一副注射器或一个吸头，但是每副注射器或每一个吸头可以滴完各株细菌的同一种噬菌体。滴加的噬菌体依次为 O-I、C、Sh、E、CE、E-4 和 Ent。滴加噬菌体时应将琼脂平板放在水平台面上，液滴应悬空滴下，不要污染针头或滴头。待 7 种噬菌体均滴加完毕后，略等数分钟待噬菌体液干燥。翻转平板，放在 36 ℃培养 5 h~6 h，和 14 h~24 h 各观察一次结果。如果仅有少数几株细菌作噬菌体试验，可用直径为 3 mm 的接种环挑取噬菌体，每一满环相当于 5 L，依次加在菌斑上，尽量减少在室温放置的时间。 5.2.5 试验结果的判定必要时（例如不能测定到完整的血清型），可吸取少许剩余的蛋白胨水培养物作靛基质试验，大肠埃希氏菌一般为靛基质阳性，沙门氏菌为靛基质阴性。噬菌体试验的结果见表 1。 5.2.6 供快速检验沙门氏菌的噬菌体简化诊断法采用如下 3 种噬菌体：沙门氏菌 O-I 噬菌体；E 多价噬菌体，内含 E 和 Sh；C 多价噬菌体，内含 C、 CE 和 Ent。培养基和试验菌液的准备均同前法。涂抹试验菌液：斑点涂抹法将琼脂平板表面分为 4 等分或 6 等分，每等分可供涂抹一株细菌培养物，每株培养物涂抹 3 个菌斑，外圈 2 个，内圈 1 个。棉签涂抹法可将试验菌液在琼脂平板上涂抹成带状，每个平板约可涂抹 5 条菌带，置数分钟，待菌斑干燥。依次滴加上述 3 种噬菌体。斑点涂抹法，一般可把 O-I 噬菌体滴加在内圈的菌斑上。带状涂抹法，可将 O-I 噬菌体滴加在菌带的左边。待噬菌体液滴干燥后，翻转平板，在 36 ℃培养 5 h ~6 h，和 14 h ~24 h 各观察一次结果。按表 2 判定结果。 5.3 噬菌体不裂解培养物的补充生化试验少数沙门氏菌培养物不被 O-I 噬菌体裂解，少数大肠埃希氏菌培养物不被相应噬菌体裂解，不被各种噬菌体裂解的培养物接种三糖铁琼脂，按 GB 4789.4 做 5 项生化试验，血清学分型鉴定后判定结果。 5.4 血清学分型鉴定及其他补充试验 5.4.1 沙门氏菌分型鉴定按 GB 4789.4 进行。如果判定为沙门氏菌时，应得出完整的血清学分型鉴定的结果。 5.4.2 致泻大肠埃希氏菌鉴定 5.4.2.1 按 GB 4789.6 和 GB 4789.36 进行。分离的菌株应该同时被同样的几个噬菌体裂解后，用大肠埃希氏菌分型噬菌体试验，这些菌株应该具有相同的裂解模式，同时测定 1 RTD 噬菌体的裂解情况。 5.4.2.2 产肠毒素大肠埃希氏菌，应有肠毒素试验的证实。 5.4.2.3 侵袭性大肠埃希氏菌，典型的生化特性为：赖氨酸脱羧酶试验阴性、无动力、产气或不产气（O124 血清型亦可以为有动力、不产气），靛基质试验阳性。可进一步做豚鼠角膜试验，结果应该为阳性，质粒电泳应证明具有 120~140 Mdal 大质粒，PCR 试验证明具有 ipaC 或 ipaH 基因。 5.4.2.4 产志贺毒素大肠埃希氏菌 O157:H7，典型的生化特性为：乳糖、蔗糖产酸，葡萄糖产酸并多数产气，硫化氢阴性，靛基质阳性，山梨醇迟缓发酵。PCR 试验证明具有产志贺毒素基因 stx1，stx2 和溶血毒素基因 hly。1RTD 的 E-2 噬菌体裂解试验，能被 1RTD 的 E-2 噬菌体裂解（裂解程度包括从 CL 到少数几个噬斑）。对于产志贺毒素和溶血毒素其他血清型的大肠埃希氏菌，按照 5.4.2.3 的程序进行鉴定。 5.4.2.5 肠道致病性大肠埃希氏菌具有大肠埃希氏菌的典型生化特性，eae 基因（黏附屏蔽基因）的 PCR 试验为阳性。产志贺毒素大肠埃希氏菌 eae 试验也可为阳性。EAF（黏附因子质粒基因）或 bfp（菌毛捆绑形成基因）的 PCR 试验可进一步证实。 5.4.3 志贺氏菌分型鉴定 5.4.3.1 挑取三糖铁琼脂上的培养物，按噬菌体裂解模式，选用相应的志贺氏菌分型因子血清，做玻片凝集试验。血清学分型鉴定结果见表 3。 5.4.3.2 如按噬菌体裂解模式结果为福氏志贺氏菌 1~5 型，先用福氏多价血清做凝集试验。如呈现凝集，再分别用各型和群因子血清检查，以确定所属血清型和亚型（见 GB 4789.5）。 5.4.3.3 如按噬菌体裂解模式结果为福氏 6 型，鲍氏各型或痢疾 3~12 型，先用福氏 6 型血清做凝集试验。福氏 6 型血清不凝集者，用鲍氏多价血清或痢疾 3~12 型多价血清做凝集试验，如果呈现凝集，再分别用各型因子血清检查。 5.4.3.4 如按噬菌体裂解模式结果为宋内氏 II 相菌而不被宋内氏血清凝集时，可直接按噬菌体裂解模式和粗糙型菌落特征判定之。 5.4.3.5 按噬菌体裂解模式结果做血清学试验不凝集者，或虽发现其被某一个分型因子血清凝集而与噬菌体裂解模式不相符者，或虽与噬菌体裂解模式相符但不被 1 RTD 的 Sh 噬菌体裂解者，均应做葡萄糖铵试验以与大肠埃希氏菌相鉴别。葡萄糖铵试验阳性者为大肠埃希氏菌。必要时可做如下生化试验：醋酸盐、克氏柠檬酸盐和粘液酸的利用试验，赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶试验，七叶苷分解试验。除宋内氏菌鲍氏 13 型为鸟氨酸脱羧酶阳性，并有少数宋内氏菌菌株可利用黏液酸外，志贺氏菌属的培养物均为阴性结果。上述试验任何阳性结果均提示为大肠埃希氏菌（按 GB 4789.5）。 5.4.3.6 检出的志贺氏菌培养物应符合该群的生化特性。福氏志贺氏菌 6 型符合鲍氏志贺氏菌的特性。靛基质阳性的志贺氏菌血清型有痢疾 2 型、7 型和 8 型，鲍氏 5、7、9、11、13、15、16 和 17 型。福氏志贺氏菌 1~5 型的靛基质反应较弱。靛基质阴性的志贺氏菌血清型为痢疾 1 型、3~6 型、9~12 型、福氏 6 型、鲍氏 1~4、6、8、10、12、14 和 18 型、宋内氏菌。 5.4.3.7 鲍氏志贺氏菌 13型是唯一可被沙门氏菌O-I裂解的菌株，该菌株只被高效价的 Sh噬菌体裂解。 5.5 结果报告 5.5.1 沙门氏菌检验的结果报告 5.5.1.1 O-I 噬菌体裂解，其他噬菌体均不裂解者，经沙门氏菌血清分型后报告。 5.5.1.2 各种噬菌体不裂解，生化试验结果为沙门氏菌，经沙门氏菌血清分型后报告，不可报告为未定型。 5.5.2 志贺氏菌检验的结果报告 5.5.2.1 Sh ......

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