路径: 主页 > GB > 第29页 > GB 5009.22-2016 | 标准编号 | GB 5009.22-2016 (GB5009.22-2016) | | 中文名称 | 食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定 | | 英文名称 | National food safety standard - B-group and G-group aflatoxins in foods | | 行业 | 国家标准 | | 中标分类 | X04 | | 国际标准分类 | 67.050 | | 字数估计 | 37,311 | | 发布日期 | 2016-12-23 | | 实施日期 | 2017-06-23 | | 旧标准 (被替代) | GB 5009.24-2010 Partly; GB/T 18979-2003; GB/T 23212-2008 Partly; GB/T 5009.22-2003; GB/T 5009.23-2006; NY/T 1286-2007; SN 0339-1995; SN/T 1101-2002; SN/T 1664-2005 Partly; SN/T 1736-2006 | | 标准依据 | National Health and Family Planning Commission Notice No.17 of 2016 | | 发布机构 | 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会、国家食品药品监督管理总局 | | 范围 | 本标准规定了食品中黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2(以下简称AFT B1、AFT B2 、AFT G1和AFT G2)的测定方法。本标准第一法为同位素稀释液相色谱-串联质谱法，适用于谷物及其制品、豆类及其制品、坚果及籽类、油脂及其制品、调味品、婴幼儿配方食品和婴幼儿辅助食品中AFT B1、AFT B2 、AFT G1和AFT G2的测定。本标准第二法为高效液相色谱一柱前衍生法，适用于谷物及其制品、豆类及其制品、坚果及籽类、油脂及其制品、调味品、婴幼儿配方食品和婴幼儿辅助食品中 | GB 5009.22-2016
Determination of aflatoxin B1, B2, G1, G2, M1, M2 content in milk and milk powde--HPLC-fluorescence detection method
中华人民共和国国家标准
食品安全国家标准
食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定
2016-12-23发布
2017-06-23实施
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会
国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 总 局 发 布
前言
本标准代替 GB/T 5009.22-2003《食品中黄曲霉毒素B1 的测定》、GB/T 5009.23-2006《食品中
黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定》、GB5009.24-2010《食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素M1和B1
的测定》、GB/T 23212-2008《牛奶和奶粉中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2的测定 液相色谱-荧光
检测法》、GB/T 18979-2003《食品中黄曲霉毒素的测定 免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光
度法》、SN0339-1995《出口茶叶中黄曲霉毒素B1检验方法》、SN/T 1664-2005《牛奶和奶粉中黄曲霉
毒素 M1、B1、B2、G1、G2含量的测定》、SN/T 1101-2002《进出口油籽及粮谷中黄曲霉毒素的检验方
法》、SN0637-1997《出口油籽、坚果及坚果制品中黄曲霉毒素的检验方法 液相色谱法》、SN/T 1736-
2006《进出口蜂蜜中黄曲霉毒素的检验方法 高效液相色谱法》、NY/T 1286-2007《花生黄曲霉毒素
B1的测定 高效液相色谱法》。
本标准与GB/T 5009.22-2003相比,主要变化如下:
---标准名称修改为“食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定”;
---根据GB 2761-2011的要求,增加了方法的适用范围;
---增加了同位素稀释液相色谱-串联质谱法为第一法;
---增加了高效液相色谱-柱前衍生法为第二法;
---增加了高效液相色谱-柱后衍生法为第三法;
---修改了酶联免疫法,并将方法名称更改为酶联免疫吸附筛查法;
---增加了免疫亲和柱以及酶联免疫试剂盒质量判定要求与方法;
---修改了测定组分为黄曲霉毒素B族和G族化合物。
食品安全国家标准
食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定
1 范围
本标准规定了食品中黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2(以下简称
AFTB1、AFTB2、AFTG1和AFTG2)的测定方法。
本标准第一法为同位素稀释液相色谱-串联质谱法,适用于谷物及其制品、豆类及其制品、坚果及籽
类、油脂及其制品、调味品、婴幼儿配方食品和婴幼儿辅助食品中AFTB1、AFTB2、AFTG1和AFTG2
的测定。
本标准第二法为高效液相色谱-柱前衍生法,适用于谷物及其制品、豆类及其制品、坚果及籽类、油
脂及其制品、调味品、婴幼儿配方食品和婴幼儿辅助食品中 AFTB1、AFTB2、AFTG1和 AFTG2的
测定。
本标准第三法为高效液相色谱-柱后衍生法,适用于谷物及其制品、豆类及其制品、坚果及籽类、油
脂及其制品、调味品、婴幼儿配方食品和婴幼儿辅助食品中 AFTB1、AFTB2、AFTG1和 AFTG2的
测定。
本标准第四法为酶联免疫吸附筛查法,适用于谷物及其制品、豆类及其制品、坚果及籽类、油脂及其
制品、调味品、婴幼儿配方食品和婴幼儿辅助食品中AFTB1的测定。
本标准第五法为薄层色谱法,适用于谷物及其制品、豆类及其制品、坚果及籽类、油脂及其制品、调
味品中AFTB1的测定。
第一法 同位素稀释液相色谱-串联质谱法
2 原理
试样中的黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2,用乙腈-水溶液或甲醇-水
溶液提取,提取液用含1%TritonX-100(或吐温-20)的磷酸盐缓冲溶液稀释后(必要时经黄曲霉毒素固
相净化柱初步净化),通过免疫亲和柱净化和富集,净化液浓缩、定容和过滤后经液相色谱分离,串联质
谱检测,同位素内标法定量。
3 试剂和材料
除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的一级水。
3.1 试剂
3.1.1 乙腈(CH3CN):色谱纯。
3.1.2 甲醇(CH3OH):色谱纯。
3.1.3 乙酸铵(CH3COONH4):色谱纯。
3.1.4 氯化钠(NaCl)。
3.1.5 磷酸氢二钠(Na2HPO4)。
3.1.6 磷酸二氢钾(KH2PO4)。
3.1.7 氯化钾(KCl)。
3.1.8 盐酸(HCl)。
3.1.9 TritonX-100[C14H22O(C2H4O)n](或吐温-20,C58H114O26)。
3.2 试剂配制
3.2.1 乙酸铵溶液(5mmol/L):称取0.39g乙酸铵,用水溶解后稀释至1000mL,混匀。
3.2.2 乙腈-水溶液(84+16):取840mL乙腈加入160mL水,混匀。
3.2.3 甲醇-水溶液(70+30):取700mL甲醇加入300mL水,混匀。
3.2.4 乙腈-水溶液(50+50):取50mL乙腈加入50mL水,混匀。
3.2.5 乙腈-甲醇溶液(50+50):取50mL乙腈加入50mL甲醇,混匀。
3.2.6 10%盐酸溶液:取1mL盐酸,用纯水稀释至10mL,混匀。
3.2.7 磷酸盐缓冲溶液(以下简称PBS):称取8.00g氯化钠、1.20g磷酸氢二钠(或2.92g十二水磷酸
氢二钠)、0.20g磷酸二氢钾、0.20g氯化钾,用900mL水溶解,用盐酸调节pH至7.4±0.1,加水稀释
至1000mL。
3.2.8 1%TritonX-100(或吐温-20)的PBS:取10mLTritonX-100(或吐温-20),用PBS稀释至1000mL。
3.3 标准品
3.3.1 AFTB1标准品(C17H12O6,CAS:1162-65-8):纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书的
标准物质。
3.3.2 AFTB2标准品(C17H14O6,CAS:7220-81-7):纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书的
标准物质。
3.3.3 AFTG1标准品(C17H12O7,CAS:1165-39-5):纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书的
标准物质。
3.3.4 AFTG2标准品(C17H14O7,CAS:7241-98-7):纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书的
标准物质。
3.3.5 同位素内标13C17-AFTB1(C17H12O6,CAS:157449-45-0):纯度≥98%,浓度为0.5μg/mL。
3.3.6 同位素内标13C17-AFTB2(C17H14O6,CAS:157470-98-8):纯度≥98%,浓度为0.5μg/mL。
3.3.7 同位素内标13C17-AFTG1(C17H12O7,CAS:157444-07-9):纯度≥98%,浓度为0.5μg/mL。
3.3.8 同位素内标13C17-AFTG2(C17H14O7,CAS:157462-49-7):纯度≥98%,浓度为0.5μg/mL。
注:标准物质可以使用满足溯源要求的商品化标准溶液。
3.4 标准溶液配制
3.4.1 标准储备溶液(10μg/mL):分别称取AFTB1、AFTB2、AFTG1和AFTG21mg(精确至0.01mg),
用乙腈溶解并定容至100mL。此溶液浓度约为10μg/mL。溶液转移至试剂瓶中后,在-20℃下避光保
存,备用。临用前进行浓度校准(校准方法参见附录A)。
3.4.2 混合标准工作液(100ng/mL):准确移取混合标准储备溶液(1.0μg/mL)1.00mL至100mL容
量瓶中,乙腈定容。此溶液密封后避光-20℃下保存,三个月有效。
3.4.3 混合同位素内标工作液(100ng/mL):准确移取0.5μg/mL13C17-AFTB1、13C17-AFTB2、13C17-
AFTG1和13C17-AFTG2各2.00mL,用乙腈定容至10mL。在-20℃下避光保存,备用。
3.4.4 标准系列工作溶液:准确移取混合标准工作液(100ng/mL)10μL、50μL、100μL、200μL、
500μL、800μL、1000μL至10mL容量瓶中,加入200μL100ng/mL的同位素内标工作液,用初始流
动相定容至刻度,配制浓度点为0.1ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、8.0ng/mL、
10.0ng/mL的系列标准溶液。
4 仪器和设备
4.1 匀浆机。
4.2 高速粉碎机。
4.3 组织捣碎机。
4.4 超声波/涡旋振荡器或摇床。
4.5 天平:感量0.01g和0.00001g。
4.6 涡旋混合器。
4.7 高速均质器:转速6500r/min~24000r/min。
4.8 离心机:转速≥6000r/min。
4.9 玻璃纤维滤纸:快速、高载量、液体中颗粒保留1.6μm。
4.10 固相萃取装置(带真空泵)。
4.11 氮吹仪。
4.12 液相色谱-串联质谱仪:带电喷雾离子源。
4.13 液相色谱柱。
4.14 免疫亲和柱:AFTB1柱容量≥200ng,AFTB1柱回收率≥80%,AFTG2的交叉反应率≥80%(验
证方法参见附录B)。
注:对于不同批次的亲和柱在使用前需进行质量验证。
4.15 黄曲霉毒素专用型固相萃取净化柱或功能相当的固相萃取柱(以下简称净化柱):对复杂基质样
品测定时使用。
4.16 微孔滤头:带0.22μm微孔滤膜(所选用滤膜应采用标准溶液检验确认无吸附现象,方可使用)。
4.17 筛网:1mm~2mm试验筛孔径。
4.18 pH计。
5 分析步骤
使用不同厂商的免疫亲和柱,在样品上样、淋洗和洗脱的操作方面可能会略有不同,应该按照供应
商所提供的操作说明书要求进行操作。
警示:整个分析操作过程应在指定区域内进行。该区域应避光(直射阳光)、具备相对独立的操作台
和废弃物存放装置。在整个实验过程中,操作者应按照接触剧毒物的要求采取相应的保护措施。
5.1 样品制备
5.1.1 液体样品(植物油、酱油、醋等)
采样量需大于1L,对于袋装、瓶装等包装样品需至少采集3个包装(同一批次或号),将所有液体
样品在一个容器中用匀浆机混匀后,其中任意的100g(mL)样品进行检测。
5.1.2 固体样品(谷物及其制品、坚果及籽类、婴幼儿谷类辅助食品等)
采样量需大于1kg,用高速粉碎机将其粉碎,过筛,使其粒径小于2mm孔径试验筛,混合均匀后缩
分至100g,储存于样品瓶中,密封保存,供检测用。
5.1.3 半流体(腐乳、豆豉等)
采样量需大于1kg(L),对于袋装、瓶装等包装样品需至少采集3个包装(同一批次或号),用组织
捣碎机捣碎混匀后,储存于样品瓶中,密封保存,供检测用。
5.2 样品提取
5.2.1 液体样品
5.2.1.1 植物油脂
称取5g试样(精确至0.01g)于50mL离心管中,加入100μL同位素内标工作液(3.4.3)振荡混合
后静置30min。加入20mL乙腈-水溶液(84+16)或甲醇-水溶液(70+30),涡旋混匀,置于超声波/涡
旋振荡器或摇床中振荡20min(或用均质器均质3min),在6000r/min下离心10min,取上清液备用。
5.2.1.2 酱油、醋
称取5g试样(精确至0.01g)于50mL离心管中,加入125μL同位素内标工作液振荡混合后静置
30min。用乙腈或甲醇定容至25mL(精确至0.1mL),涡旋混匀,置于超声波/涡旋振荡器或摇床中振
荡20min(或用均质器均质3min),在6000r/min下离心10min(或均质后玻璃纤维滤纸过滤),取上
清液备用。
5.2.2 固体样品
5.2.2.1 一般固体样品
称取5g试样(精确至0.01g)于50mL离心管中,加入100μL同位素内标工作液振荡混合后静置
30min。加入20.0mL乙腈-水溶液(84+16)或甲醇-水溶液(70+30),涡旋混匀,置于超声波/涡旋振
荡器或摇床中振荡20min(或用均质器均质3min),在6000r/min下离心10min(或均质后玻璃纤维
滤纸过滤),取上清液备用。
5.2.2.2 婴幼儿配方食品和婴幼儿辅助食品
称取5g试样(精确至0.01g)于50mL离心管中,加入100μL同位素内标工作液振荡混合后静置
30min。加入20.0mL乙腈-水溶液(50+50)或甲醇-水溶液(70+30),涡旋混匀,置于超声波/涡旋振
荡器或摇床中振荡20min(或用均质器均质3min),在6000r/min下离心10min(或均质后玻璃纤维
滤纸过滤),取上清液备用。
5.2.3 半流体样品
称取5g试样(精确至0.01g)于50mL离心管中,加入100μL同位素内标工作液振荡混合后静置
30min。加入20.0mL乙腈-水溶液(84+16)或甲醇-水溶液(70+30),置于超声波/涡旋振荡器或摇床
中振荡20min(或用均质器均质3min),在6000r/min下离心10min(或均质后玻璃纤维滤纸过滤),
取上清液备用。
5.3 样品净化
5.3.1 免疫亲和柱净化
5.3.1.1 上样液的准备
准确移取4mL上清液,加入46mL1% TritionX-100(或吐温-20)的PBS(使用甲醇-水溶液提取
时可减半加入),混匀。
5.3.1.2 免疫亲和柱的准备
将低温下保存的免疫亲和柱恢复至室温。
5.3.1.3 试样的净化
待免疫亲和柱内原有液体流尽后,将上述样液移至50mL注射器筒中,调节下滴速度,控制样液以
1mL/min~3mL/min的速度稳定下滴。待样液滴完后,往注射器筒内加入2×10mL水,以稳定流速
淋洗免疫亲和柱。待水滴完后,用真空泵抽干亲和柱。脱离真空系统,在亲和柱下部放置10mL刻度
试管,取下50mL的注射器筒,加入2×1mL甲醇洗脱亲和柱,控制1mL/min~3mL/min的速度下
滴,再用真空泵抽干亲和柱,收集全部洗脱液至试管中。在50℃下用氮气缓缓地将洗脱液吹至近干,加
入1.0mL初始流动相,涡旋30s溶解残留物,0.22μm滤膜过滤,收集滤液于进样瓶中以备进样。
5.3.2 黄曲霉毒素固相净化柱和免疫亲和柱同时使用(对花椒、胡椒和辣椒等复杂基质)
5.3.2.1 净化柱净化
移取适量上清液,按净化柱操作说明进行净化,收集全部净化液。
5.3.2.2 免疫亲和柱净化
用刻度移液管准确吸取上述净化液4mL,加入46mL1% TritionX-100(或吐温-20)的PBS[使用甲
醇-水溶液提取时,加入23mL1%TritionX-100(或吐温-20)的PBS],混匀。按5.3.1.2和5.3.1.3处理。
注:全自动(在线)或半自动(离线)的固相萃取仪器可优化操作参数后使用。
5.4 液相色谱参考条件
液相色谱参考条件列出如下:
a) 流动相:A相:5mmol/L乙酸铵溶液;B相:乙腈-甲醇溶液(50+50);
b) 梯度洗脱:32% B(0min~0.5min),45% B(3min~4min),100% B(4.2min~4.8min),
32%B(5.0min~7.0min);
c) 色谱柱:C18柱(柱长100mm,柱内径2.1mm;填料粒径1.7μm),或相当者;
d) 流速:0.3mL/min;
e) 柱温:40℃;
f) 进样体积:10μL。
5.5 质谱参考条件
质谱参考条件列出如下:
a) 检测方式:多离子反应监测(MRM);
b) 离子源控制条件:参见表1;
c) 离子选择参数:参见表2;
d) 子离子扫描图:参见图C.1~图C.8;
e) 液相色谱-质谱图:见图C.9。
表1 离子源控制条件
电离方式 ESI+
毛细管电压/kV 3.5
锥孔电压/V 30
射频透镜1电压/V 14.9
射频透镜2电压/V 15.1
表1(续)
离子源温度/℃ 150
锥孔反吹气流量/(L/h) 50
脱溶剂气温度/℃ 500
脱溶剂气流量/(L/h) 800
电子倍增电压/V 650
表2 离子选择参数表
化合物名称
母离子
(m/z)
定量离子
(m/z)
碰撞能量
eV
定性离子
(m/z)
碰撞能量
eV
离子化方式
AFTB1 313 285 22 241 38 ESI+
13C17-AFTB1 330 255 23 301 35 ESI+
AFTB2 315 287 25 259 28 ESI+
13C17-AFTB2 332 303 25 273 28 ESI+
AFTG1 329 243 25 283 25 ESI+
13C17-AFTG1 346 257 25 299 25 ESI+
AFTG2 331 245 30 285 27 ESI+
13C17-AFTG2 348 259 30 301 27 ESI+
5.6 定性测定
试样中目标化合物色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间相比较,变化范围应在±2.5%
之内。
每种化合物的质谱定性离子必须出现,至少应包括一个母离子和两个子离子,而且同一检测批次,
对同一化合物,样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比,其允许偏差
不超过表3规定的范围。
表3 定性时相对离子丰度的最大允许偏差
相对离子丰度/% >50 20~50 10~20 ≤10
允许相对偏差/% ±20 ±25 ±30 ±50
5.7 标准曲线的制作
在5.4、5.5的液相色谱串联质谱仪分析条件下,将标准系列溶液由低到高浓度进样检测,以AFTB1、
AFTB2、AFTG1和AFTG2色谱峰与各对应内标色谱峰的峰面积比值-浓度作图,得到标准曲线回归方
程,其线性相关系数应大于0.99。
5.8 试样溶液的测定
取5.3处理得到的待测溶液进样,内标法计算待测液中目标物质的质量浓度,按第6章计算样品中
待测物的含量。待测样液中的响应值应在标准曲线线性范围内,超过线性范围则应适当减少取样量重
新测定。
5.9 空白试验
不称取试样,按5.2和5.3的步骤做空白实验。应确认不含有干扰待测组分的物质。
6 分析结果的表述
试样中AFTB1、AFTB2、AFTG1和AFTG2的残留量按式(1)计算:
X=ρ
×V1×V3×1000
V2×m×1000
(1)
式中:
X ---试样中AFTB1、AFTB2、AFTG1或AFTG2的含量,单位为微克每千克(μg/kg);
ρ ---进样溶液中AFTB1、AFTB2、AFTG1或 AFTG2按照内标法在标准曲线中对应的浓
度,单位为纳克每毫升(ng/mL);
V1 ---试样提取液体积(植物油脂、固体、半固体按加入的提取液体积;酱油、醋按定容总体积),
单位为毫升(mL);
V3 ---样品经净化洗脱后的最终定容体积,单位为毫升(mL);
1000---换算系数;
V2 ---用于净化分取的样品体积,单位为毫升(mL);
m ---试样的称样量,单位为克(g)。
计算结果保留三位有效数字。
7 精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。
8 其他
当称取样品5g时,AFTB1的检出限为:0.03μg/kg,AFTB2的检出限为0.03μg/kg,AFTG1的检
出限为0.03μg/kg,AFTG2的检出限为0.03μg/kg;AFTB1的定量限为0.1μg/kg,AFTB2的定量限
为0.......
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