路径: 主页 > SN/T > 第67页 > SN/T 1201-2014 | 标准编号 | SN/T 1201-2014 (SN/T1201-2014) | | 中文名称 | 饲料中转基因植物成份PCR检测方法 | | 英文名称 | PCR protocol for detection of genetically modified plant ingredients in feed | | 行业 | 商检行业标准 (推荐) | | 中标分类 | B25 | | 字数估计 | 14,195 | | 发布日期 | 12/1/2014 | | 实施日期 | 5/1/2015 | | 旧标准 (被替代) | SN/T 1201-2003 | | 标准依据 | 国质检认[2014]614号;行业标准备案公告2016年第3号(总第195号) | | 发布机构 | 海关总署 | SN/T 1201-2014: 饲料中转基因植物成份PCR检测方法
SN/T 1201-2014 英文名称: PCR protocol for detection of genetically modified plant ingredients in feed
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T 1201—2014
代替SN/T 1201—2003
饲料中转基因植物成分PCR检测方法
中 华人民共和国国家质量监督检验检疫总局
发布
1 范围
本标准规定了饲料中转基因植物成分的定性实时荧光PCR检测方法。
本标准适用于饲料中大豆、玉米、水稻、油菜、棉花、苜蓿和小麦等转基因植物成分的定性检测和相关品系的鉴定。
本标准同样适用于玉米酒糟粕转基因成分的定性检测和相关品系的鉴定。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求
GB/T 19495.7 转基因产品检测 抽样和制样方法
3 术语、定义和缩略语
3.1 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
4原理
实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基因发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'端-3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的积累与PCR产物形成完全同步。
5 主要设备和试部
5.1 主要设备
实时荧光PCR仪、制冰机、核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计、恒温水浴锅、离心机、研钵及粉碎装置、涡旋振荡器、微量移液器(2.5μL,20μL,200μL,1000μL)。
5.2 主要试剂
除另有规定外，所有实验使用的试剂等级应为不含DNA和DNase的分析纯或生化试剂。实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格，所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。
5.2.1 CTAB提取液：20 g/L CTAB,1.4 mol/L NaCL,0.1 mol/L Tris-HCL,0.02 mol/L Nag-EDTA,
pH 8.0。
5.2.2 CTAB沉淀液：5g/LCTAB,40 mmol/L NaCl。
5.2.3 蛋白酶K溶液：20 mg/mL。
5.2.4 RNase A:100 mg/mL。
5.2.5 NaCl溶液：1.2 mol/L。
5.2.6 三氯甲烷(氯仿):(氯仿：异戊醇=24:1)。
5.2.7 异丙醇。
5.2.8 70%无水乙醇。
5.2.9 TE缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0),1 mmol/L EDTA(pH 8.0)。
5.2.10实时荧光PCR反应混合液：12.5μL反应体系包括：1U～2U的Tag酶、2×PCR缓冲液、
2.5 mmol/L～4.0 mmol/L的Mg²+、0.2 U～1 U的UNG酶、0.2 mmol/L的d(A,C,G)TPs、
0.2 mmol/L～0.4 mmol/L的dUTP、400 nmol/L的ROX染料(某些荧光PCR仪不需要ROX校正)。如有等效的商品化试剂盒，则可使用这些等效产品。
5.2.11 引物和探针：用于实时荧光PCR检测的引物和TaqMan探针见表1。
6 防污染措施
检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T 19495.2中的规定执行。
7 抽样与制样
7.1 抽样
按照GB/T 19495.7中的规定执行。
7.2 制样
称取约200g样品，用粉碎机或冷冻研磨仪将样品粉碎至细粉状。每样品取2个～4个平行样提取核酸。
8检验步骤
8.1 样品前处理
饲料种类繁多，成分极其复杂，除含有各种不同的植物成分外，可能还含有多种预混剂如蛋白粉、骨粉、氨基酸、维生素、抗生素(或兽药)、矿物质、防霉剂、驱虫剂、着色剂、调味料、粘结剂以及发酵产物等成分。饲料样品中的这些盐、糖、色素等化学物质会影响后续基因组DNA的提取，甚至可能抑制后续PCR反应等，它们应通过洗涤等方法加以去除。取200 mg粉碎饲料样品，加入2 mL离心管中，加
1.5mL双蒸水，上下颠倒后漩涡混匀，12000g离心5 min,弃上清液，沉淀加1.5 mL双蒸水，重复上述洗涤过程3次～5次。最后所得沉淀用于基因组DNA的提取。
8.2 DNA提取
8.2.1 CTAB法
CTAB提取方法如下：
a)在上述200mg前处理后样品中，加入1000μL CTAB提取缓冲液和2μL蛋白酶K溶液，65℃温育60 min,期间颠倒混匀3次～5次；或65℃温育过夜。12000g离心10 min,转移上清液至另一干净的2mL离心管中。
b)加入与上清液等体积的三氯甲烷，颠倒混匀后，12000g离心10 min,取上清液到另-2mL离心管。
c)加入2倍体积的CTAB沉淀液，颠倒混匀后，室温静置30 min,12000 g离心10 min,去上清液。
d) 向沉淀中加入500μL氯化钠溶液以溶解沉淀。
e)加2 μL RNase A,37℃温育30 min。
f) 加入等体积的三氯甲烷，颠倒混匀后，12000g离心10 min,取上清液到另一1.5mL离心管。
g)加入0.7倍体积4℃预冷的异丙醇，颠倒混匀后，于4℃静置30 min,12000g离心10 min,去上清液。
h)加入500μL4℃预冷的70%乙醇，轻轻转动离心管2次～3次，12000g离心10 min,小心去除上清液，并在室温或在真空干燥系统中干燥。
i) 加入50μLTE缓冲液溶解DNA,置4℃冰箱中保存备用。
8.2.2 试剂盒法
采用磁珠法和离心柱吸附法等不同试剂盒提取基因组DNA时，按其操作说明书操作。
8.3 DNA浓度和纯度的测定
样品DNA用紫外分光光度计测定260nm和280nm处吸收值，按式(1)和式(2)分别计算DNA纯度和浓度：
8.4 引物和探针的选择
表1用于实时荧光PCR检测的引物和TaqMan探针很多，其选择依检测样品和目的而定。第一
待测样品外源基因检测Ct值在36～40之间，应重做实时荧光PCR扩增。再次扩增后的结果Ct
值仍小于40,且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，则可判定该样品检出××基因或××品系；再次扩增后的结果......
|