路径: 主页 > SN/T > 第49页 > SN/T 5106-2019 | 标准编号 | SN/T 5106-2019 (SN/T5106-2019) | | 中文名称 | 登革热媒介蚊类DNA条形码鉴定方法 | | 英文名称 | (Dengue vector mosquito DNA barcode identification method) | | 行业 | 商检行业标准 (推荐) | | 中标分类 | C62 | | 国际标准分类 | | | 字数估计 | 13,128 | | 发布日期 | 2019-09-03 | | 实施日期 | 2020-03-01 | | 标准依据 | 海关总署公告2019年第142号 | | 发布机构 | 海关总署 | SN/T 5106-2019: 登革热媒介蚊类DNA条形码鉴定方法
SN/T 5106-2019 英文名称: (Dengue vector mosquito DNA barcode identification method)
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
登革热媒介蚊类DNA条形码鉴定方法
中华人民共和国海关总署 发 布
前言
本标准按照GB/T １．１-２００９给出的规则起草。
本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。
本标准起草单位：中华人民共和国福州海关。
本标准起草人：方义亮、张建庆、林醒忠、王宇平、黄恩炯、房长天、吴荣泉。
登革热媒介蚊类DNA条形码鉴定方法
１ 范围
本标准规定了登革热媒介蚊类ＤＮＡ条形码鉴定方法中ＤＮＡ提取、基因的扩增及序列的比对分
析、结果判定等。
蛹、残肢不全等标本的ＤＮＡ条形码鉴定。
２ 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本
文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB １９４８９ 实验室 生物安全通用要求
ＳＮ/T １８７６ 医学媒介生物标本采集、制作及保存规程
ＳＮ/T ２７５２．４ 卫生检疫人员的自我防护规范 第４部分：实验室人员
ＳＮ/T ４２７８ 国境口岸医学媒介昆虫ＤＮＡ条形码鉴定操作规程
ＷＳ/T ２３０ 临床诊断中聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术的应用
３ 方法原理
利用通用引物对线粒体ＤＮＡ中的COI基因的特定片段进行扩增，ＰＣＲ产物克隆或者直接测序
后，得到长度不少于５００ｂｐ的有效序列，与本标准的标准序列进行比对，从而达到物种快速准确鉴定的
目的。
４ 鉴定程序
４．１ 准备
实验室需具备的设备和试剂参见附录 Ａ。实验室生物安全符合GB １９４８９和ＳＮ/T ２７５２．４的规
定；ＰＣＲ防污染措施遵照 ＷＳ/T ２３０的要求。
配置电泳液 ＴＡＥ（１×ＴＡＥ）：将 Ｔｒｉｓ碱２４２ｇ，冰醋酸５７．１ｍＬ，０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）
１００ｍＬ，定容至１Ｌ，用双蒸水稀释５０倍。
４．２ 标本处理
４．２．１ 取样
标本样品经过冷冻或乙醚麻醉，死后取成批同种样品的单份标本、珍稀单份标本取对称一侧组织
（如单侧蚊足）置于灭菌的洁净１．５ｍＬ离心管留用，如长期不用需放置体积分数为９０％以上乙醇
-２０℃保存。标本的其它同种个体或者部分针插作为凭证标本。
４．２．２ 凭证标本制作
将取样后的标本制作成凭证标本，标本的制作按照ＳＮ/T １８７６的要求执行。
４．３ DNA制备
将单份样品（成虫、幼虫、蛹）置于已灭菌的洁净１．５ｍＬ离心管后用研磨棒研磨，利用商品化昆虫
ＤＮＡ提取试剂盒进行蚊虫基因组提取（样品为单只蚊的，需去掉头部后（如有吸血的需要去腹部）后再
研磨）；样品为少量对称一侧组织（单侧蚊足）置于已灭菌的洁净１．５ｍＬ离心管后用研磨棒研磨，利用
微量组织ＤＡＮ提取方法（参见附录Ｂ）进行蚊虫基因组的制备，制备好的ＤＮＡ进行浓度及纯度测定
后，保存至-２０℃冰箱备用。
４．４ PCR扩增
４．４．１ 引物
４．４．２ 扩增体系
推荐用５０μＬ体系，可用商品化的ＰＣＲｍｉｘ。验证ＰＣＲ体系有无污染，可同时设置空白对照和阴性对照；验证ＰＣＲ反应正常，可设置阳性对照。
ＴａｑＰＣＲＭａｓｔｅｒｍｉｘ ２５μＬ正反引物（１０μＭ） 各４μＬ模板（５０～１００μｇ／μＬ） ３μＬｄｄＨ２Ｏ １４μＬ为了提高反应的效果，根据模板的浓度，可以适当增加模板的体积，同时相应减少ｄｄＨ２Ｏ体积，体
系体积不变。
４．４．３ 扩增条件
第一步：９４℃５ｍｉｎ；
第二步：９５℃３０ｓ，４６℃３０ｓ，７２℃４０ｓ，３５个循环；
第三步：７２℃７ｍｉｎ。
４．５ PCR产物检测
４．５．１ 琼脂糖凝胶的配置
称取１．５ｇ的琼脂粉倒进盛有１００ｍＬ１×ＴＡＥ的烧瓶内，置入微波炉加热使其充分溶解直至透亮
即可。
４．５．２ 电泳
取５μＬＰＣＲ扩增产物（内含有染料），点样于质量浓度为１．５％的琼脂糖凝胶（含有溴化乙锭），电泳缓冲液为１×ＴＡＥ，在恒压８０Ｖ电泳３０ｍｉｎ，用凝胶成像系统成像并拍摄。
４．６ 序列测定
ＣＯＩ序列扩增产物电泳条带在７５０ｂｐ左右（参见附录Ｃ），具有目的片段电泳条带的扩增产物可委
托专业的测序公司进行双向测定（测序引物同扩增引物），送样具体按照所选公司的要求进行。有条件
的实验室可以选择克隆测序，克隆的流程按ＳＮ/T ４２７８规定执行。
４．......
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