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[PDF] SN/T 5225-2019 - 英文版

标准号码	内文	价格美元	第2步(购买)	交付天数	标准名称	状态
SN/T 5225-2019	英文版	349	SN/T 5225-2019	[PDF]天数 >=3	进出口食品中五种致泻大肠埃希氏菌快速检测方法多重PCR法	有效

基本信息
标准编号	SN/T 5225-2019 (SN/T5225-2019)
中文名称	进出口食品中五种致泻大肠埃希氏菌快速检测方法多重PCR法
英文名称	(Rapid detection method of five diarrhea-causing Escherichia coli in imported and exported foods)
行业	商检行业标准 (推荐)
中标分类	C53
国际标准分类	67.050
字数估计	15,198
发布日期	2019
实施日期	2020-07-01
发布机构	海关总署

SN/T 5225-2019: 进出口食品中五种致泻大肠埃希氏菌快速检测方法多重PCR法 SN/T 5225-2019 英文名称: (Rapid detection method of five diarrhea-causing Escherichia coli in imported and exported foods) 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准中华人民共和国海关总署发布进出口食品中五种致泻大肠埃希氏菌快速检测方法　多重 PCR 法前言本标准依照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国郑州海关、解放军疾病预防控制中心、中国动物卫生与流行病学中心、中华人民共和国拱北海关、中华人民共和国福州海关。本标准主要起草人: 苗丽、王永亮、张灿、李阳、王俊杰、张秀平、党志浩、李轲、冯家旺、郑晶。进出口食品中五种致泻大肠埃希氏菌快速检测方法　多重 PCR 法 1　范围本标准规定了进出口食品中肠致病性大肠埃希氏菌（EPEC），肠出血性大肠埃希氏菌（EHEC，又称产志贺毒素大肠埃希氏菌），肠产毒性大肠埃希氏菌（ETEC），肠侵袭性大肠埃希氏菌（EIEC ），肠集聚性大肠埃希氏菌（EAEC）五种致泻大肠埃希氏菌快速检测方法。本标准适用于各种进出口食品及其原料，有专门规定检验方法的除外。其它产品可参考使用本标准。 2　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 27403 实验室质量控制规范食品分子生物学检测 5　方法提要本标准依据致泻性大肠埃希氏菌的致病机理，检测致病型 EPEC（bfpB、 escV）、EIEC （invE）、 ETEC（elt、 estIa、estIb）、EHEC（escV 、stx1A、stx2A ）、EAEC（astA、aggR、pic），采用多重 PCR 技术，根据 PCR 扩增产物的条带大小确定致泻性大肠埃希氏菌致病型别。 6　设备和材料 6.1　恒温培养箱，36℃ ±1℃，42℃ ±1℃。 6.2　均质器。 6.3　振荡器。 6.4　无菌均质杯或无菌均质袋；容量 500mL。 6.5　无菌培养皿；直径 90 mm。 6.6　一次性接种环。 6.7　移液器：量程分别为 1 mL、5 mL 和 10 mL，刻度为 0.1 mL。 6.8　微量移液器：0.5 µL ～ 2 µL、2 µL ～ 20 µL、20 µL ～ 200 µL。 6.9　灭菌 PCR 反应管。 6.10　电子天平：感量 0.1 g、0.01 g。 6.11　恒温水浴箱：100℃。 6.12　冷冻离心机：控温 4℃～ 8℃，最大转速不小于 13 000 r/min。 6.13　核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 6.14　PCR 扩增仪。 6.15　核酸电泳仪，包括电源、电泳槽、制胶槽（长度 >10 cm）和梳子。 6.16　凝胶成像系统。 7 培养基和试剂除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯。实验用水符合 GB/T 6682 中一级水的要求。所有试剂均用无 DNA 酶污染的容器分装。 7.1　营养肉汤：见附录 A 中 A.1.1。 7.2　肠道菌增菌肉汤：见附录 A 中 A.1.2。 7.3　麦康凯琼脂（MAC）：见附录 A 中 A.1.3。 7.4　伊红美兰琼脂（EMB）：见附录 A 中 A.1.4。 7.5　TE 缓冲液：见附录 A 中 A.1.5。 7.6　10×PCR 缓冲液：见附录 A 中 A.1.6。 7.7　50×TAE 缓冲液：见附录 A 中 A.1.7。 8　检验程序食品中五种致泻大肠埃希氏菌检验程序见图 1。图 1　食品中五种致泻大肠埃希氏菌检验程序 9　操作步骤 9.1　样品制备、增菌培养和分离以无菌操作取检样 25 g（或 25 mL），加入装有灭菌 225 mL 营养肉汤的均质杯中，用旋转刀片式均质器以 8 000 r/min ~10 000 r/min 均质 1 min~2 min ；或加入装有 225 mL 营养肉汤的均质袋中，用拍击式均质器均质 1 min~2 min。液体样品震荡混匀即可。于 36℃ ±1℃培养 6 h。取 10 µL，接种于 30 mL 肠道菌增菌肉汤管内，于 42℃ ±1℃培养 18 h。将增菌液划线接种 MAC 和 EMB 琼脂平板，于 36℃ ±1℃培养 18 h~24 h，观察菌落特征。在 MAC 琼脂平板上，分解乳糖的典型菌落为砖红色，不分解乳糖的菌落为无色或者是淡粉色。在 EMB 琼脂平板上，分解乳糖的典型菌落为中心紫黑色带或不带金属光泽，不分解乳糖的菌落为无色或者是淡粉色。 9.2　细菌模板 DNA 的制备 9.2.1　使用接种环挑取平板上可疑致泻性大肠埃希氏菌 10 个 ~20 个（10 个以下全选），挑取菌落时不但要挑取乳糖发酵的菌落，同时也要挑取乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落，打散至盛有 1mL 0.85% 灭菌生理盐水的 Eppendorf 管内，13 000 r/min 离心（4℃～ 8℃）2 min，弃上清液。 9.2.2　加入 50 µL ～ 100 µL 1×TE 缓冲液至 Eppendorf 管中，充分混匀。 9.2.3　100℃水浴或者金属浴维持 10 min，将 Eppendorf 管置于冰上冷却。 9.2.4　13 000 r/min 离心 10 min，上清为 PCR 扩增模板，用于 PCR 扩增。 9.2.5　每次 PCR 反应使用 EPEC、EIEC 、ETEC、EHEC、EAEC 标准菌株作为阳性对照。同时，使用大肠埃希氏菌 CICC 10003 或等效标准菌株作为阴性对照，以灭菌去离子水作为空白对照，控制 PCR 体系污染。致泻大肠埃希氏菌特征性基因见表 1。也可使用商业化的 DNA 提取试剂盒并其按说明制备模板 DNA。 9.3　DNA 浓度和纯度的测定使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测 260 nm 和 280 nm 处的吸光值 A260 和 A280。 9.4　多重 PCR 扩增 9.4.1　PCR 反应体系（25 µL）：10×PCR 反应缓冲液（含 Mg2+）3 µL ；2.5 mM dNTP Mixture 3 µL; 5 U/µL Ex Taq DNA 聚合酶 0.4 µL ；10 µmol/L 引物对各 2 µL ；50 ng/µL 模板 DNA 2 µL ；水补足至 25 µL。 9.4.2　反应条件：预变性 95℃ 4 min ；变性 95℃ 30 s ；62℃ 退火 30 s ；延伸 72℃ 1.5 min，30 个循环；72℃ 延伸 5 min，4℃ 保存反应产物。注：PCR 反应参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当的调整。 9.5　多重 PCR 扩增产物的电泳检测 1×TAE 电泳缓冲液制备 1.8% ~ 2% 琼脂糖凝胶；55℃ ~ 60℃时加入溴化乙锭至终浓度为 0.5 µg/mL。取 8 µL ~ 15 µL PCR 产物，分别和 2 µL 6× 上样缓冲液混匀后进行点样，用 DNA 分子 Marker 作参照。5 V/cm 电压，电泳 20 min ～ 40 min，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。 9.6　测序当电泳结果出现可疑阳性时，将 PCR 扩增产物进行 DNA 测序。 10　结果判定及表述 10.1　质量控制 10.1.1　阳性对照：五种致泻性大肠埃希氏菌对照用阳性标准菌株扩增基因产物大小应符合表 1 ； 10.1.2　阴性对照：无相应条带出现； 10.1.3　空白对照：......

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