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[PDF] SN/T 5227.7-2019 - 英文版

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SN/T 5227.7-2019	英文版	209	SN/T 5227.7-2019	[PDF]天数 >=3	出口食品中马源性成分快速检测重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA法)	有效

基本信息
标准编号	SN/T 5227.7-2019 (SN/T5227.7-2019)
中文名称	出口食品中马源性成分快速检测重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA法)
英文名称	(Rapid detection of horse-derived ingredients in exported foods Recombinase-mediated strand replacement nucleic acid amplification method (RAA method))
行业	商检行业标准 (推荐)
中标分类	C53
国际标准分类	67.050
字数估计	9,947
发布日期	2019
实施日期	2020-07-01
发布机构	海关总署

SN/T 5227.7-2019: 出口食品中马源性成分快速检测重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA法) SN/T 5227.7-2019 英文名称: (Rapid detection of horse-derived ingredients in exported foods Recombinase-mediated strand replacement nucleic acid amplification method (RAA method)) 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出口食品中马源性成分快速检测重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）中华人民共和国海关总署发布前言 SN/T 5227-2019《出口食品中动物源性成分快速检测重组酶介导链替换核酸扩增（RAA）法》预计分为如下部分： --第 1 部分：出口食品中鸡源性成分快速检测重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）； --第 2 部分：出口食品中猪源性成分快速检测重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）； --第 3 部分：出口食品中羊源性成分快速检测重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）； --第 4 部分：出口食品中鸭源性成分快速检测重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）； --第 5 部分：出口食品中牛源性成分快速检测重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）； --第 6 部分：出口食品中水牛源性成分快速检测重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）； --第 7 部分：出口食品中马源性成分快速检测重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）； --第 8 部分：出口食品中驴源性成分快速检测重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）； --第 9 部分：出口食品中狐狸源性成分快速检测重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）； --第 10 部分：出口食品中貂源性成分快速检测重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）； --第 11 部分：出口食品中大鼠源性成分快速检测重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）。本部分为 SN/T 5227-2019 第 7 部分。本部分按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本部分由中华人民共和国海关总署提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国郑州海关、中华人民共和国厦门海关、郑州牧业经济学院、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国北京海关、中华人民共和国大连海关、中华人民共和国成都海关、中华人民共和国石家庄海关、杭州众测生物科技有限公司。本部分主要起草人：苗丽、徐淑菲、王海花、张秀平、韩建勋、汪琳、郑秋月、林华、孔繁德、王建昌、程奇。出口食品中马源性成分快速检测重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法） 1 范围 SN/T 5227-2019 的本部分规定了出口食品中马源性成分的 RAA 检测方法。本部分适用于出口食品中马源性成分的定性检测。 2 规范性引用文件此部分所规定方法的最低检出限（LOD）为 0.1 %（W/W）。下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403-2008 实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3 术语、定义和缩略语 4 方法提要以提取的 DNA 为模板，采用马的特异性检测引物和探针进行实时荧光 RAA 扩增，根据实时荧光 RAA 的增幅情况，实现对食品和饲料中马成分的检测鉴定。 5 试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合 GB/T 6682 的要求。所有试剂均用无 DNA 酶污染的容器分装。 5.1 CTAB 提取缓冲液（pH8.0）：10 g/L CTAB，0.7 mol/L NaCl，0.05 mol/L Tris-HCl，0.01 mol/L Na2EDTA。 5.2 酚：氯仿：异戊醇 =25 ： 24 ： 1。 5.3 异丙醇。 5.4 70% 乙醇（体积比）。 5.5 TE 缓冲液（pH8.0）：10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1 mmol/L EDTA（pH8.0）。 5.6 缓冲液 A ：20 % 聚乙二醇。 5.7 实时荧光 RAA 扩增体系：2.5 mmol/L dNTPs，225 ng/µL SSB，300 ng/µL recA 重组酶蛋白（SC- recA/BS-recA），75 ng/µL Bsu DNA 聚合酶，75 ng/µL Exo 核酸外切酶，250 mmol/L Tricine，12.5 mmol/ L 二硫苏糖醇，250 ng/µL 肌酸激酶。也可以使用等效的商品化的试剂盒代替。 5.8 缓冲液 B ：280 mol/L 醋酸镁。 6 仪器设备 6.1 实时荧光 PCR 仪。 6.2 恒温荧光检测仪。 6.3 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 6.4 恒温水浴锅。 6.5 离心机：转速大于等于 12 000 r/min。 6.6 微量移液器：量程 0.5 µL~10 µL，10 µL~100 µL，20 µL~200 µL，200 µL~1 000 µL。 6.7 研钵及粉碎装置。 6.8 涡旋振荡器。 6.9 离心管：2 mL、1.5 mL。 7 检测步骤 7.1 DNA 提取取 0.2 g 粉碎或磨碎的样品至一洁净的 1.5 mL 离心管（6.9）中（若样品含杂质和调味品，可加入 1 mLdd H2O 洗涤两次），加入 600 µL CTAB 提取缓冲液（pH8.0）（5.1），涡旋振荡混匀后于 70 ℃温育 15 min，期间颠倒离心管 2 次 ~3 次； 12 000 r/min 离心 5 min，取上清液于一新的干净 1.5 mL 离心管中；加入 500 µL 酚：氯仿：异戊醇（25 ： 24 ： 1）（5.2），上下颠倒离心管 2~3 次后涡旋振荡混匀， 12 000 r/min 离心 5 min ；转移上层水相至一新的 1.5 mL 离心管中，加入 0.7 倍体积异丙醇（5.3），上下颠倒离心管 2~3 次，4 ℃静置 30 min，4 ℃下 12 000 r/min 离心 3 min，小心弃去上清液；加入 700 µL 70 % 乙醇（5.4），重悬沉淀，12 000 r/min 离心 1 min，小心弃去上清液；打开管盖，室温挥发干液体，加入 50 µL ~100 µL TE 缓冲液（pH8.0）（5.5）溶解 DNA，-20 ℃保存备用。 7.2 DNA 浓度和纯度的测定使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测 260 nm 和 280 nm 处的吸光值 A260 和 A280。DNA 的浓度按照式（1）计算： 7.3.2 实时荧光 RAA 反应程序 7.3.2.1 实时荧光 PCR 仪 39 ℃，60 s，1 个循环；39 ℃，30 s，40 个循环，在每次循环时收集荧光。 7.3.2.2 恒温荧光检测仪 39 ℃，1 min ；39 ℃，20 min，第二阶段开始收集荧光。 7.3.3 实验对照检测过程中分别设阳性对照、阴性对照、空白对照。采用含有马源成分的样品作为阳性对照样品，不含马源成分的样品作为阴性对照样品，以与模板等体积的双蒸水作为空白对照样品。 8 质量控制 8.1 实时荧光 PCR 仪 8.1.1 空白对照：无荧光对数增长，相应的无报告 Ct 值。 8.1.2 阴性对照：无荧光对数增长，相应的无报告 Ct 值。 8.1.3 阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的 Ct 值小于等于 30.0。 8.2 恒温荧光检测仪 8.2.1 空白对照：无荧光对数增长，相应的无报告 T 值（时间）。 8.2.2 阴性对照：无荧光对数增长，相应的无报告 T 值（时间）。 8.2.3 阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的 T 值（时间）小于等于 15 min。 9 结果判断与表述 9.1　结果判定 9.1.1 实时荧光 PCR 仪 9.1.1.1 在符合条款 8.1 的情况下，结果才能判为有效。 9.1.1.2 如 Ct 值小于等于 35.0，则判定被检样品阳性。 9.1.1.3 如大于 35.0 小于 40.0，则重复一次。如再次检测结果仍然是大于 ......

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