路径: 主页 > YY/T > 第27页 > YY/T 0993-2015 | 标准编号 | YY/T 0993-2015 (YY/T0993-2015) | | 中文名称 | 医疗器械生物学评价 纳米材料:体外细胞毒性试验(MTT试验和LDH试验) | | 英文名称 | Biological evaluation of medical devices. Nanomaterial: In vitro cytotoxicity tests (MTT assay and LDH assay) | | 行业 | 医药行业标准 (推荐) | | 中标分类 | C30 | | 国际标准分类 | 11.040.30 | | 字数估计 | 15,126 | | 发布日期 | 2015-03-02 | | 实施日期 | 2016-01-01 | | 引用标准 | GB/T 16886.1; GB/T 16886.5; GB/T 16886.12 | | 标准依据 | 国家食品药品监督管理总局公告2015年第8号 | | 发布机构 | 国家食品药品监督管理总局 | | 范围 | 本标准规定了纳米材料及组合在医疗器械中的纳米材料的体外细胞毒性试验方法、试样设备、操作步骤及评价。本标准适用于纳米材料及组合在医疗器械中的纳米材料(颗粒或纤维被包裹或结合在一种不能释放或非游离状态的除外)的体外细胞毒性评价, 包括以L929为受试细胞的MTT试验和LDH试验。本标准是GB/T 16886.5的补充。 | YY/T 0993-2015: 医疗器械生物学评价 纳米材料:体外细胞毒性试验(MTT试验和LDH试验)
YY/T 0993-2015 英文名称: Biological evaluation of medical devices. Nanomaterial: In vitro cytotoxicity tests (MTT assay and LDH assay)
ICS 11.040.30
C30
中华人民共和国医药行业标准
医疗器械生物学评价 纳米材料:
体外细胞毒性试验(MTT试验和LDH试验)
1 范围
本标准规定了纳米材料及组合在医疗器械中的纳米材料的体外细胞毒性试验方法、试样制备、操作步骤及评价。
本标准适用于纳米材料及组合在医疗器械中的纳米材料(颗粒或纤维被包裹或结合在一种不能释
放或非游离状态的除外)的体外细胞毒性评价,包括以L929为受试细胞的 MTT试验和LDH 试验。
本标准是GB/T 16886.5的补充。
5 细胞系
可参照GB/T 16886.5选择细胞系,推荐使用L929细胞。也可根据产品的使用部位和特点选择其
他能得出相同或更佳结果的细胞系,但需经过验证,证明其反应的重现性和准确性。
如果肝脏、肾脏可能为纳米材料的靶器官时,则可选择人源肝肿瘤细胞
注:使用冻存细胞时应传代2~3代以后用于试验。
6 培养液
可参照GB/T 16886.5保存和使用培养液,应符合选定细胞系的生长要求。
7 试验过程
7.1 概述
本试验是将纳米材料稀释液或纳米材料医疗器械的浸提液接触培养细胞,通过MTT和LDH两种
试验方法分别评价对细胞线粒体的毒性作用和对细胞膜的毒性作用。
试验中使用的试剂、耗材及设备详见附录A。
本试验为在一个试验过程中获得两个试验结果:
a) MTT试验:3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基-2氢-四氮唑溴是一种黄色的水溶性四氮唑染料,可被活细胞还
原为紫色非水溶性甲瓒。MTT试验是用二甲基亚砜(DMSO)溶解甲瓒,并通过微孔板分光
光度计(酶标仪)定量甲瓒,对比试验组和对照组的吸光值,评估测试样品细胞毒性的方法。
b) LDH试验:乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)是一种细胞质酶,细胞裂解后即释放到
细胞外。因此,LDH试验可用于检测细胞膜的完整性。LDH试验原理:
1) LDH氧化乳酸形成丙酮酸盐;
2) 丙酮酸盐和四唑盐反应转化成甲瓒;
3) 该甲瓒染料可溶于水,并可通过微孔板分光光度计检测。
7.2 试验步骤
7.2.1 准备细胞
可参照GB/T 16886.5准备细胞。或者按细胞供应者推荐方法进行。
注:本步骤及以下所有试验操作均在无菌条件下进行。
7.2.2 细胞接种
用细胞培养液(含10%胎牛血清)稀释细胞悬液,调整浓度至1×105 个细胞/mL,于96孔板内每孔接种100μL。
每个样品或每个浓度5个重复孔(或不少于3个重复孔)。细胞播种和加样可参照附录B。
7.2.3 细胞培养
37℃、5% 二氧化碳、湿度≥90%条件下培养24h(细胞生长至70%~80%的汇合状态)。
7.2.4 试验样品与对照样品加样
7.2.4.1 如果试验样品为纳米材料原材料的稀释液,或可分散于细胞培养液的样品,则每一种纳米材料
或样品需测试5~7个不同的浓度(在有剂量-反应关系的范围内进行稀释,并验证试验系统是否有效)。
试验样品为纳米材料原材料时,所配纳米颗粒的最高浓度应在其最大可溶性范围内。对于非可溶
性金属纳米颗粒,可根据预试验选择最大的毒性浓度为初始浓度(如:细胞生长抑制率在80%左右);最
小浓度宜获得10%左右的细胞生长抑制率。
7.2.4.2 如果试验样品为含纳米材料医疗器械的浸提液,而且浸提液中纳米材料的含量很低(细胞毒性
小于或等于Ⅱ级),则只需测试浸提液原液,无需稀释;但如果浸提液中纳米材料的含量较高(细胞毒性
大于或等于Ⅲ级),宜稀释5~7个不同的浓度。在不同浓度的浸提液稀释液中分别添加10%FBS用于试验样品。
注:宜避免对浸提液进行处理,例如对pH值的调整。如需要调整pH值时宜给出说明。
取出生长细胞的96孔板,按照模板排列顺序加入100μL的试验样品和对照样品。加样后继续培养24h。
注:每个实验组均设置无细胞加样对照,即指没有细胞,只有培养液,并添加同样试验样品的对照孔,测得的吸光度
值作为背景值,在最后的计算时实际样品测定值应扣除无细胞加样的背景值,从而扣除某些纳米颗粒对吸光度测定的干扰。
7.2.5 检测
7.2.5.1 MTT试验
7.2.5.1.1 从培养箱中取出96孔板,弃去准备用作Triton-X-100阳性对照组孔内的液体,加入100μL
1% Triton-X-100(4.3.1中制备)。室温下放置10min,700g离心3min。
7.2.5.1.2 从每孔中吸出50μL液体,转移至另一块96孔板(按原来模板的样品分布转移),暂放4℃
保存,尽快进行LDH试验(见7.2.5.2)。
7.2.5.1.3 弃去初始96孔板内的所有液体,每孔加200μL的新鲜培养液。
7.2.5.1.4 每孔再加入50μL的 MTT溶液(最终浓度为1mg/mL),37℃下孵育4h。
7.2.5.1.5 取出96孔板,700g离心3min。
7.2.5.1.6 吸出培养液和 MTT溶液。
7.2.5.1.7 每孔加200μLDMSO。
7.2.5.1.8 每孔添加25μL甘氨酸缓冲液,置振荡器上混匀10min。
7.2.5.1.9 用酶标仪检测,检测波长570nm,参考波长680nm 或根据试验体系验证结果选择其他波长。
7.2.5.2 LDH试验
7.2.5.2.1 取出已有转移出50μL液体的96孔板(见7.2.5.1.2),每孔加入50μL反应混合液
(见4.4.2),在涡旋混匀器上混匀。
7.2.5.2.2 室温下避光孵育30min。
7.2.5.2.3 用酶标仪检测,检测波长490nm,参考波长680nm 或根据试验体系验证结果选择其他波长。
8 数据记录与分析
8.1 数据记录
所有试验样品、阳性对照、阴性对照和溶剂对照各重复5个孔。全部测试结果应以表格形式记录。
在计算时,每个孔的吸光值需要扣除其相应的无细胞加样组的吸光值,然后将5个孔的数值相加后求算术平均值。
8.3 结果分析
8.3.1 试验样品为纳米材料原材料时,由 MTT试验数据和LDH试验数据绘制得到浓度-反应曲线。
对于所得到的浓度-反应曲线,需要对其反应曲线方程进行非线性拟合,从获得的方程式中计算IC50。
注:本标准中IC50是指 MTT试验结果中相对细胞活性(相对增殖率)的抑制率达到50%时的试验样品浓度和LDH
试验结果中细胞LDH相对释放率为50%时的试验样品浓度。
8.3.2 试验样品为含纳米材料医疗器械的浸提液时,直接报告8.2.1、8.2.2的计算结果(包括平行样或
重复孔的平均值±标准偏差)。
9 接受准则
9.1 试验质量控制:
a) 每次试验中应设阳性对照和阴性对照;
b) 溶剂对照组(未做任何处理)的OD570应大于或等于0.2,以证实接种的1×104细胞/每孔是
否在2d的试验过程中处在正常的倍增生长期。
9.2 对于乙酰氨基酚(APAP)阳性对照组,其24h的细胞增殖率不超过50%,且LDH总释放率应大于10%。
9.3 如果该浓度试验组的细胞相对活性(增殖率)与溶剂对照组相比<70%,则判断该浓度有细胞毒
性;试验组50%浸提液的细胞相对活性(增殖率)应至少等于或高于100%试验组浸提液的细胞相对活
性(增殖率),否则,试验需要重做。
9.4 若满足9.2、9.3,则试验可接受,否则应重复试验。
注:任何被排除的数值(异常值除外)也应在报告中说明。
10 结果评定
总的试验结果应结合其试验样品的其他生物相容性试验结果和预期的临床使用用途进行评定。
细胞毒性试验结果的解释宜根据医疗器械的风险管理级别(GB/T 16886.1),结合纳米材料的物理
化学表征(如粒径大小、表面电荷、聚散状态等)充分讨论所可能引起的潜在风险。
如果试验结果提示有细胞毒性,必要时可进行进一步的评价,如:
a) 增加试验(有血清和无血清、或改变血清的浓度);
b) 浸提液分析(如灭菌或加工过程的残留物分析)。
许多纳米材料被证实具有一定的细胞毒性,而有些纳米材料,如纳米银本身具有抗菌杀菌作用,具
有较强的细胞毒性。至于试验样品的细胞毒性是否能被预期的临床使用所接受则需要综合分析,或者
进一步进行动物试验来综合判断其人体使用时可能的风险。
附 录 A
(资料性附录)
试剂、耗材及设备
A.1 试剂
A.1.1 3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基-2氢-四氮唑溴盐(MTT)。
A.1.2 ......
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