| 标准编号 | GB 31658.14-2021 (GB31658.14-2021) | | 中文名称 | | | 英文名称 | National food safety standard - Determination of o-trenbolone, B-trenbolone residues in animal derived food by liquid chromatography-tandem mass spectrometric method | | 行业 | 国家标准 | | 中标分类 | X04 | | 字数估计 | 8,880 | | 发布机构 | 中华人民共和国国家卫生健康委员会、国家市场监督管理总局 | GB 31658.14-2021: 食品安全国家标准 动物性食品中α-群勃龙和β-群勃龙残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
食品安全国家标准
动物性食品中α-群勃龙和β-群勃龙
残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
中华人民共和国国家标准
中华人民共和国国家卫生健康委员会发布
国 家 市 场 监 督 管 理 总 局
中华人民共和国农业农村部
前言
本文件按照GB/T １.１-２０２０《标准化工作导则 第１部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草.
本文件系首次发布.
１ 范围
本文件规定了动物性食品中α-群勃龙和β-群勃龙残留量测定的制样和液相色谱-串联质谱检测方法.
本文件适用于猪、牛、羊、鸡的肌肉、脂肪、肝脏和肾脏组织及兔肉、鸡蛋、牛奶和羊奶中α-群勃龙和β-群勃龙残留量的测定.
２ 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,
仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本
文件.
GB/T ６６８２ 分析实验室用水规格和试验方法
３ 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义.
４ 原理
试料中残留的α-群勃龙和β-群勃龙在弱酸性条件下酶解,用叔丁基甲醚提取,正己烷除脂,HLB和氨
基固相萃取柱净化,液相色谱-串联质谱法测定,外标法定量.
５ 试剂和材料
除另有规定外,所有试剂均为分析纯,水为符合GB/T ６６８２规定的一级水.
５.１ 试剂
５.１.１ 乙腈(CH３CN):色谱纯.
５.１.２ 甲醇(CH３OH):色谱纯.
５.１.３ 叔丁基甲醚(C５H１２O).
５.１.４ 正己烷(C６H１４).
５.１.５ 冰乙酸(CH３COOH).
５.１.６ 氨水(NH３.H２O):含量(NH３)约２５％.
５.１.７ 乙酸钠(C２H３NaO２).
５.１.８ 丙酮(C３H６O).
５.１.９ β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶:＞１０００００U/mL.
５.２ 溶液配制
５.２.１ ０.０４mol/L乙酸钠溶液:取乙酸钠３.２８g,用水溶解并稀释至１０００mL.
５.２.２ ８０％甲醇水溶液:取甲醇８０mL,用水稀释至１００mL.
５.２.３ １０％甲醇水溶液:取甲醇１０mL,用水稀释至１００mL.
５.２.４ ２％氨水溶液:取氨水８mL,用水稀释至１００mL.
５.２.５ 甲醇-２％氨水溶液(５∶９５):取甲醇５mL,加２％氨水(５.２.４)９５mL,混匀.
５.２.６ 甲醇-２％氨水溶液(４０∶６０):取甲醇４０mL,加２％氨水(５.２.４)６０mL,混匀.
５.２.７ 丙酮-甲醇溶液(８０∶２０):取丙酮８０mL,加甲醇２０mL,混匀.
５.３ 标准品
５.３.１ α-群勃龙(１７α-Trenbolone,C１８H２２O２,CAS号:８０６５７-１７-６):含量≥９８.５％.
５.３.２ β-群勃龙(１７β-Trenbolone,C１８H２２O２,CAS号:１０１６１-３３-８):含量≥９８.０％.
５.４ 标准溶液制备
５.４.１ 标准储备液:取α-群勃龙、β-群勃龙标准品各约１０mg,精密称定,用甲醇适量使溶解并稀释定容至１０mL容量瓶,配制成浓度均为１mg/mL的α-群勃龙、β-群勃龙标准储备液.-１８℃以下保存,有效期６个月.
５.４.２ 混合标准中间液:准确量取α-群勃龙、β-群勃龙标准储备液各１mL,于１０mL容量瓶中,用甲醇稀
释至刻度,配制成浓度为１００μg/mL的混合标准中间液.-１８℃以下保存,有效期３个月.
５.４.３ 混合标准工作液:分别精密量取混合标准中间液适量,用甲醇稀释,配制成浓度分别为２０ng/mL、５０ng/mL、１００ng/mL、２００ng/mL、５００ng/mL和１０００ng/mL的混合标准工作液.现配现用.
５.５ 材料
５.５.１ HLB固相萃取柱１):２００mg/３mL,或相当者.
１) 此处列出 HLB固相萃取柱仅是为了提供参考,并不涉及商业目的,鼓励标准使用者尝试采用不同厂家或型号的固相萃取柱.
５.５.２ 氨基固相萃取柱:５００mg/６mL,或相当者.
６ 仪器和设备
６.１ 液相色谱-串联质谱仪:配电喷雾离子源.
６.２ 分析天平:感量０.００００１g和感量０.０１g.
６.３ pH计.
６.４ 离心机:转速可达５０００r/min.
６.５ 涡旋混合器.
６.６ 恒温摇床.
６.７ 水平振荡器.
６.８ 固相萃取装置.
６.９ 氮吹仪.
６.１０ 尼龙微孔滤膜:０.２２μm.
７ 试料的制备与保存
７.１ 试料的制备
７.１.１ 肌肉、脂肪、肝脏和肾脏组织
取适量新鲜或解冻的空白或供试组织,绞碎,并使均质.
a) 取均质后的供试样品,作为供试试料;
b) 取均质后的空白样品,作为空白试料;
c) 取均质后的空白样品,添加适宜浓度的标准工作液,作为空白添加试料.
７.１.２ 奶
取适量新鲜或解冻的空白或供试奶,混合均匀.
a) 取均质后的供试样品,作为供试试料;
b) 取均质后的空白样品,作为空白试料;
c) 取均质后的空白样品,添加适宜浓度的标准工作液,作为空白添加试料.
７.１.３ 鸡蛋
取适量新鲜或冷藏的空白或供试鸡蛋,去壳,并使均质.
a) 取均质后的供试样品,作为供试试料;
b) 取均质后的空白样品,作为空白试料;
c) 取均质后的空白样品,添加适宜浓度的标准工作液,作为空白添加试料.
７.２ 试料的保存
-１８℃以下保存.
８ 测定步骤
８.１ 酶解
取试料５g(准确至±０.０２g),置５０mL离心管,加０.０４mol/L乙酸钠溶液１０mL,涡旋混合,用冰乙酸调pH至４.３~４.８.加β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶２０μL,涡旋混合,于恒温水浴摇床,３７℃振荡１４h以上.
８.２ 提取
酶解液冷却至室温,加叔丁基甲醚１０mL(牛奶、羊奶试料先加入乙腈５mL),涡旋混合,振荡１０min,
５０００r/min离心１０min,取上层液于另一离心管中.下层液用叔丁基甲醚１０mL重复提取一次,合并２次上层液,于５０℃水浴氮气吹干.加入８０％甲醇水溶液４mL,超声２min,溶解残余物.加正己烷５mL(脂肪试料加１０mL),振荡５min,５０００r/min离心１０min,弃上层正己烷.再加入正己烷５mL(脂肪试料加１０mL)重复上述操作.取下层水相,５０℃水浴氮气吹至约０.５mL,加入１０％甲醇水溶液３mL,超声５min,溶解残余物备用.
８.３ 净化
HLB固相萃取柱依次用甲醇３mL、水３mL活化,取备用液过柱,依次用甲醇-２％氨水溶液(５∶９５)
３mL、甲醇-２％氨水溶液(４０∶６０)３mL和水３mL淋洗,抽干.取用丙酮-甲醇溶液(８０∶２０)５mL活化的氨基固相萃取柱串接在HLB固相萃取柱下方,用丙酮-甲醇(８０∶２０)５mL洗脱,收集洗脱液,于５０℃水浴氮气吹干.用８０％甲醇溶液１.０mL溶解残余物,超声５min,涡旋１min,过０.２２μm尼龙微孔滤膜,供液相色谱-串联质谱测定.
８.４ 基质添加标准曲线的制备
准确量取混合标准工作液适量,分别加入６份空白试料中,添加浓度分别为０.４μg/kg、１μg/kg、
２μg/kg、４μg/kg、１０μg/kg和２０μg/kg,充分混匀.按酶解、提取和净化步骤操作,制成浓度分别为２ng/mL、５ng/mL、１０ng/mL、２０ng/mL、５０ng/mL和１００ng/mL的系列基质添加标准溶液,供液相色谱-串联质谱仪测定.以定量离子对质量色谱峰面积为纵坐标、相对应的标准溶液浓度为横坐标,绘制标准曲线,求回归方程和相关系数.
８.５ 测定
８.５.１ 色谱参考条件
a) 色谱柱:C１８柱(１００mm×２.１mm,１.７μm),或相当者;
b) 流动相:A为水,B为乙腈;
c) 梯度洗脱:洗脱条件见表１;
d) 流速:０.３mL/min;
e) 柱温:４０℃;
f) 进样量:５μL.
８.６ 测定法
８.６.１ 定性测定
在同样测试条件下,试料溶液中α-群勃龙和β-群勃龙色谱峰的保留时间与基质添加标准溶液中相应
峰的保留时间相对偏差在±２.５％以内,且检测到的相对离子丰度,应当与浓度相当的基质添加标准溶液相对离子丰度一致.其允许偏差应符合表３的要求.
８.６.２ 定量测定
取试料溶液和相应的基质添加标准溶液,作单点或多点校准,按外标法以特征离子质量色谱峰面积定
量,基质添加标准溶液及试料溶液中的α-群勃龙和β-群勃龙响应值均应在仪器检测的......
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