| 标准编号 | GB 5009.111-2016 (GB5009.111-2016) | | 中文名称 | 食品安全国家标准 食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定 | | 英文名称 | [Including 2025XG1] Determination of deoxynivalenol in food -- High performance liquid chromatographic method with immunoaffinity column clean-up | | 行业 | 国家标准 | | 中标分类 | X04 | | 字数估计 | 23,244 | | 发布日期 | 2016-12-23 | | 实施日期 | 2017-06-23 | | 旧标准 (被替代) | GB/T 23503-2009; GB/T 5009.111-2003; SN/T 1571-2005 | | 标准依据 | National Health and Family Planning Commission Notice No.17 of 2016 | | 发布机构 | 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会、国家食品药品监督管理总局 | GB 5009.111-2016
Determination of deoxynivalenol in food--High performance liquid chromatographic method with immunoaffinity column clean-up
中华人民共和国国家标准
食品安全国家标准
食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇
及其乙酰化衍生物的测定
2016-12-23发布
2017-06-23实施
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会
国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 总 局 发 布
前言
本标准代替GB/T 5009.111-2003《谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定》、GB/T 23503-
2009《食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定 免疫亲和层析净化高效液相色谱法》、SN/T 1571-2005
《进出口粮谷中呕吐毒素检验方法 液相色谱法》。
本标准与 GB/T 5009.111-2003相比,主要变化如下:
---标准名称修改为“食品安全国家标准食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测
定”;
---增加了方法的适用范围;
---增加了食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇乙酰化衍生物的测定;
---增加了同位素稀释液相色谱-串联质谱法;
---增加了固相萃取柱净化的前处理方式;
---增加了免疫亲和柱净化-高效液相色谱法;
---增加了商业化免疫亲和柱评价技术参数要求。
食品安全国家标准
食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇
及其乙酰化衍生物的测定
1 范围
本标准规定了食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定方法。
第一法为同位素稀释液相色谱-串联质谱法,适用于谷物及其制品、酒类、酱油、醋、酱及酱制品中脱
氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇和15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定。
第二法为免疫亲和层析净化高效液相色谱法,适用于谷物及其制品、酒类、酱油、醋、酱及酱制品中
脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定。
第三法为薄层色谱测定法,第四法为酶联免疫吸附筛查法,适用于谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀菌
烯醇的测定。
第一法 同位素稀释液相色谱-串联质谱法
2 原理
试样中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇和15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇用水和
乙腈的混合溶液提取,提取上清液经固相萃取柱或免疫亲和柱净化,浓缩、定容和过滤后,超高压液相色
谱分离,串联质谱检测,同位素内标法定量。
3 试剂和材料
除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的一级水。
3.1 试剂
3.1.1 乙腈(CH3CN):色谱纯。
3.1.2 甲醇(CH3OH):色谱纯。
3.1.3 正己烷(C6H14)。
3.1.4 氨水(NH3·H2O)。
3.1.5 甲酸(HCOOH)。
3.1.6 氮气(N2):纯度≥99.9%。
3.2 试剂配制
3.2.1 乙腈-水溶液(84+16):量取160mL水加入到840mL乙腈中,混匀。
3.2.2 乙腈饱和的正己烷溶液:量取200mL正己烷于250mL分液漏斗中,加入少量乙腈,剧烈振摇
数分钟,静置分层,弃去下层乙腈层即得。
3.2.3 甲醇-水溶液(5+95):量取5mL甲醇加入到95mL水中,混匀。
3.2.4 0.01%氨水溶液:取100μL氨水加入到1000mL水中,混匀(仅供离子源模式为ESI-时使用)。
3.2.5 0.1%甲酸溶液:取1mL甲酸加入到1000mL水中,混匀(仅供离子源模式为ESI+时使用)。
3.3 标准品
3.3.1 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON,C15H20O6,CAS号:51481-10-8):纯度≥99%,或经国家认证并授予
标准物质证书的标准物质。
3.3.2 3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-ADON,C17H22O6,CAS号:50722-38-8):纯度≥99%,或经国家
认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.3.3 15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-ADON,C17H22O6,CAS号:88337-96-6):纯度≥99%,或经国
家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.3.4 13C15-脱氧雪腐镰刀菌烯醇同位素标准溶液(13C-DON,13C15H20O6):25μg/mL,纯度≥99%。
3.3.5 13C17-3-乙酰-脱氧雪腐镰刀菌烯醇同位素标准溶液(13C-3-ADON,13C17H22O6):25μg/mL,纯度
≥99%。
3.4 标准溶液配制
3.4.1 标准储备溶液(100μg/mL):分别称取DON、3-ADON和15-ADON1mg(准确至0.01mg),分
别用乙腈溶解并定容至10mL。将溶液转移至试剂瓶中,在-20℃下密封保存,有效期1年。
3.4.2 混合标准工作溶液(10μg/mL):准确吸取100μg/mLDON、3-ADON和15-ADON标准储备液
各1.0mL于同一10mL容量瓶中,加乙腈定容至刻度。在-20℃下密封保存,有效期半年。
3.4.3 混合同位素内标工作液(1μg/mL):准确吸取13C15-DON 和13C17-3-ADON 同位素内标
(25μg/mL)各1mL于同一25mL容量瓶中,加乙腈定容至刻度。在-20℃下密封保存,有效期
半年。
3.4.4 标准系列工作溶液:准确移取适量混合标准工作溶液和混合同位素内标工作液,用初始流动相
配制成10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、160ng/mL、320ng/mL、640ng/mL的混合标准
系列,其中同位素内标浓度为100ng/mL。标准系列溶液于4℃保存,有效期7d。
4 仪器和设备
4.1 液相色谱-串联质谱仪:带电喷雾离子源。
4.2 电子天平:感量0.01g和0.00001g。
4.3 高速粉碎机:转速10000r/min。
4.4 匀浆机。
4.5 筛网:0.5mm~1mm孔径。
4.6 超声波/涡旋振荡器或摇床。
4.7 氮吹仪。
4.8 高速离心机:转速不低于12000r/min。
4.9 移液器:量程10μL~100μL和100μL~1000μL。
4.10 固相萃取装置。
4.11 通用型固相萃取柱:兼具亲水基团(吡咯烷酮基团)和疏水基团(二乙烯基苯)吸附剂填料的固相
萃取小柱,200mg,6mL,或相当者。
4.12 DONs专用型固相净化柱,或相当者。
4.13 脱氧雪腐镰刀菌烯醇免疫亲和柱:柱容量≥1000ng(柱容量和柱回收率验证方法参见A.2)。
4.14 水相微孔滤膜:0.22μm。
5 分析步骤
5.1 试样制备
5.1.1 谷物及其制品:取至少1kg样品,用高速粉碎机将其粉碎,过筛,使其粒径小于0.5mm~1mm
孔径试验筛,混合均匀后缩分至100g,储存于样品瓶中,密封保存,供检测用。
5.1.2 酒类:取散装酒至少1L,对于袋装、瓶装等包装样品至少取3个包装(同一批次或号),将所有液
体试样在一个容器中用均质机混匀后,缩分至100g(mL)储存于样品瓶中,密封保存,供检测用。含二
氧化碳的酒类样品使用前应先置于4℃冰箱冷藏30min,过滤或超声脱气后方可使用。
5.1.3 酱油、醋、酱及酱制品:取至少1L样品,对于袋装、瓶装等包装样品至少取3个包装(同一批次或
号),将所有液体样品在一个容器中用匀浆机混匀后,缩分至100g(mL)储存于样品瓶中,密封保存,供
检测用。
5.2 试样提取
5.2.1 谷物及其制品:称取2g(准确至0.01g)试样于50mL离心管中,加入400μL混合同位素内标
工作液振荡混合后静置30min。加入20.0mL乙腈-水溶液(84+16),置于超声波/涡旋振荡器或摇床
中超声或振荡20min。10000r/min离心5min,收集上清液A于干净的容器中备用。
5.2.2 酒类:称取5g(准确至0.01g)试样于50mL离心管中,加入200μL混合同位素内标工作液振
荡混合后静置30min,用乙腈定容至10mL,混匀,置于超声波/涡旋振荡器或摇床中超声或振荡
20min。10000r/min离心5min,收集上清液B于干净的容器中备用。
5.2.3 酱油、醋、酱及酱制品:称取2g(准确至0.01g)试样于50mL离心管中,加入400μL混合同位
素内标工作液振荡混合后静置30min。加入20.0mL乙腈-水溶液(84+16),置于超声波/涡旋振荡器
或摇床中超声或振荡20min。10000r/min离心5min,收集上清液C于干净的容器中备用。
5.3 试样净化
注:下述试样的净化方法,可根据实际情况,选择其中一种方法即可。
5.3.1 通用型固相萃取柱净化
取5mL上清液A或上清液B或上清液C置于50mL离心管中,加入10mL乙腈饱和正己烷溶
液,涡旋混合2min,5000r/min离心2min,弃去正己烷层后,于40℃~50℃下氮气吹干,加入4mL
水充分溶解残渣,待净化。
将固相萃取柱连接到固相萃取装置,先后用3mL甲醇和3mL水活化平衡。将4mL上述水复溶
液上柱,控制流速为每秒1滴~2滴。用3mL水、1mL5%甲醇-水溶液依次淋洗柱子后彻底抽干。用
4mL甲醇洗脱,收集全部洗脱液后在40℃~50℃下氮气吹干。加入1.0mL初始流动相溶解残留物,
涡旋混匀10s,用0.22μm微孔滤膜过滤于进样瓶中,待进样。
5.3.2 DONs专用型固相净化柱净化
取8mL上清液A或上清液B或上清液C至DONs专用型固相净化柱的玻璃管内,将净化柱的填
料管插入玻璃管中并缓慢推动填料管至净化液析出,移取5mL净化液于40℃~50℃下氮气吹干。加
入1.0mL初始流动相溶解残留物,涡旋混匀10s,用0.22μm微孔滤膜过滤于进样瓶中,待进样。
注:使用不同厂商的DONs专用型固相净化柱,在上样、净化等操作方面可能略有不同,可按照说明书要求进行
操作。
5.3.3 免疫亲和柱净化
事先将低温下保存的免疫亲和柱恢复至室温。
准确移取5mL上清液A或上清液B或上清液C,于40℃~50℃下氮气吹干,加入2mL水充分
溶解残渣,待免疫亲和柱内原有液体流尽后,将上述样液移至玻璃注射器筒中。将空气压力泵与玻璃注
射器相连接,调节下滴速度,控制样液以每秒1滴的流速通过免疫亲和柱,直至空气进入亲和柱中。用
5mLPBS缓冲盐溶液和5mL水先后淋洗免疫亲和柱,流速约为每秒1滴~2滴,直至空气进入亲和注
中,弃去全部流出液,抽干小柱。
准确加入2mL甲醇洗脱亲和柱,控制每秒1滴的下滴速度,收集全部洗脱液至试管中,在50℃下
用氮气缓缓地将洗脱液吹至近干,加入1.0mL初始流动相,涡旋30s溶解残留物,0.22μm滤膜过滤,
收集滤液于进样瓶中以备进样。
注:使用不同厂商的免疫亲和柱,在样品上样、淋洗和洗脱的操作方面可能略有不同,应该按照说明书要求进行
操作。
5.4 液相色谱-串联质谱参考条件(可根据实际情况参考其中一种方法即可)
5.4.1 离子源模式:ESI+
液相色谱-质谱参考条件列出如下:
a) 液相色谱柱:C18柱(柱长100mm,柱内径2.1mm;填料粒径1.7μm),或相当者;
b) 流动相:A相:0.1%甲酸溶液;B相:0.1%甲酸-乙腈;
c) 梯度洗脱:2% B (0min~0.8min),24% B (3.0min~4.0min),100% B (6.0min~
6.9min),2%B(6.9min~7.0min);
d) 流速:0.35mL/min;
e) 柱温:40℃;
f) 进样体积:10μL;
g) 毛细管电压:3.5kV;锥孔电压:30V;脱溶剂气温度:350℃;脱溶剂气流量:900L/h;
h) 脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物质谱条件参考表1。
表1 脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物质谱参考条件(ESI+)
化合物
名 称
母离子
(m/z)
锥孔电压
eV
定量离子
(m/z)
碰撞电压
eV
定性离子
(m/z)
碰撞电压
eV
DON 297 20 249 10 203 16
3-ADON 339 17 231 13 203 13
15-ADON 339 18 137 9 321 7
13C-DON 312 20 263 10 245 16
13C-3-ADON 356 17 245 13 - -
注:3-ADON和15-ADON为同分异构体,15-ADON可选用13C-3-ADON作为同位素内标进行相应的定量计算。
5.4.2 离子源模式:ESI-
液相色谱-质谱参考条件列出如下:
a) 液相色谱柱:C18柱(柱长100mm,柱内径2.1mm;填料粒径1.7μm),或相当者;
b) 流动相:A相:0.01%氨水溶液;B相:乙腈;
c) 梯度洗脱:2%B(0min~0.8min),24%B(3.0min~4.0min),100%B(6.0min~6.9min),
2%B(6.9min~7.0min);
d) 流速:0.35mL/min;
e) 柱温:40℃;
f) 进样体积:10μL;
g) 毛细管电压:2.5kV;锥孔电压:45V;脱溶剂气温度:500℃;脱溶剂气流量:900L/h;
h) 脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物质谱条件参考表2。
表2 脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物质谱参考条件(ESI-)
化合物
名 称
母离子
(m/z)
锥孔电压
eV
定量离子
(m/z)
碰撞电压
eV
定性离子
(m/z)
碰撞电压
eV
DON 295 14 265 12 138 18
3-ADON 337 12 307 10 173 12
15-ADON 337 12 150 12 219 12
13C-DON 310 16 279 12 145 14
13C-3-ADON 354 18 323 14 230 18
注:3-ADON和15-ADON为同分异构体,15-ADON可选用13C-3-ADON作为同位素内标进行相应的定量计算。
各化合物的离子扫描图、多反应监测(MRM)离子通道图参见图B.1~图B.8。
5.5 定性测定
试样中目标化合物色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间相比较,变化范围应在±2.5%
之内。
每种化合物的质谱定性离子应出现,至少应包括一个母离子和两个子离子,而且同一检测批次,对
同一化合物,样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比,其允许偏差不
超过表3规定的范围。
表3 定性时相对离子丰度的最大允许偏差
相对离子丰度 >50% 20%~50% 10%~20% ≤10%
允许的相对偏差 ±20% ±25% ±30% ±50%
5.6 标准曲线的制作
在5.4液相色谱串联质谱仪分析条件下,将标准系列溶液由低到高浓度进样检测,以 DON、3-
ADON和15-ADON色谱峰与各对应内标色谱峰的峰面积比值-浓度作图,得到标准曲线回归方程,其
线性相关系数应大于0.99。
5.7 试样溶液的测定
取5.2、5.3处理得到的待测溶液进样,内标法计算待测液中目标物质的质量浓度,按6计算样品中
待测物的含量。试液中待测物的响应值应在标准曲线线性范围内,超过线性范围则应适当减少取样量
后重新测定。
5.8 空白试验
除不加试样外,按5.3和5.4的步骤做空白实验。应确认不含有干扰待测组分的物质。
6 分析结果的表述
试样中DON、3-ADON或15-ADON的含量按式(1)计算:
X=ρ
×V1×V3×1000
V2×m×1000
(1)
式中:
X ---试样中DON、3-ADON或15-ADON的含量,单位为微克每千克(μg/kg);
ρ ---试样中DON、3-ADON或15-ADON按照内标法在标准曲线中对应的质量浓度,单位为
纳克每毫升(ng/mL);
V1 ---试样提取液体积,单位为毫升(mL);
V3 ---试样最终定容体积,单位为毫升(mL);
1000---换算系数;
V2 ---用于净化的分取体积,单位为毫升(mL);
m ---试样的称样量,单位为克(g)。
计算结果保留三位有效数字。
7 精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的23%。
8 其他
当称取谷物及其制品、酒类、酱油、醋、酱及酱制品试样2g时,方法中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙
酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇检出限为10μg/kg,定量限为20μg/kg。
当称取酒类试样5g时,方法中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰脱氧
雪腐镰刀菌烯醇检出限为5μg/kg,定量限为10μg/kg。
第二法 免疫亲和层析净化高效液相色谱法
9 原理
试样中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇用水提取,经免疫亲和柱净化后,用高效液相色谱-紫外检测器测定,
外标法定量。
10 试剂和材料
除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的一级水。
10.1 试剂
10.1.1 甲醇(CH3OH):色谱纯。
10.1.2 乙腈(CH3CN):色谱纯。
10.1.3 聚乙二醇[相对分子质量为8000,HO(CH2CH2O)nH]。
10.1.4 氯化钠(NaCl)。
10.1.5 磷酸氢二钠(Na2HPO4)。
10.1.6 磷酸二氢钾(KH2PO4)。
10.1.7 氯化钾(KCl)。
10.1.8 盐酸(HCl)。
10.2 试剂配制
10.2.1 磷酸盐缓冲溶液(以下简称PBS):称取8.00g氯化钠、1.20g磷酸氢二钠、0.20g磷酸二氢钾、
0.20g氯化钾,用900mL水溶解,用盐酸调节pH至7.0,用水定容至1000mL。
10.2.2 甲醇-水溶液(20+80):量取200mL甲醇加入到800mL水中,混匀。
10.2.3 乙腈-水溶液(10+90):量取100mL乙腈加入到900mL水中,混匀。
10.3 标准品
脱氧雪腐镰刀菌烯醇(C15H20O6,CAS号:51481-10-8):纯度≥99%,或经国家认证并授予标准物质
证书的标准物质。
10.4 标准溶液配制
10.4.1 标准储备溶液(100μg/mL):称取脱氧雪腐镰刀菌烯醇1mg(准确至0.01mg),用乙腈溶解并
定容至10mL。将溶液转移至试剂瓶中,在-20℃下密封保存,有效期1年。
10.4.2 标准系列工作溶液:准确移取适量脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准储备溶液用初始流动相稀释,配制
成100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL、5000ng/mL的标准系列工作液,
4℃保存,有效期7d。
11 仪器和设备
11.1 高效液相色谱仪:配有紫外检测器或二极管阵列检测器。
11.2 电子天平:感量0.01g和0.00001g。
11.3 高速粉碎机:转速10000r/min。
11.4 筛网:1mm~2mm孔径。
11.5 超声波/涡旋振荡器或摇床。
11.6 氮吹仪。
11.7 高速离心机:转速≥12000r/min。
11.8 移液器:量程10μL~100μL和100μL~1000μL。
11.9 脱氧雪腐镰刀菌烯醇免疫亲和柱:柱容量≥1000ng。(柱容量和柱回收率验证方法参见A.2)。
注:对于不同批次的亲和柱在使用前需质量验证。
11.10 玻璃纤维滤纸:直径11cm,孔径1.5μm。
11.11 水相微孔滤膜:0.45μm。
11.12 聚丙烯刻度离心管:具塞,50mL。
11.13 玻璃注射器:10mL。
11.14 空气压力泵。
12 分析步骤
使用不同厂商的免疫亲和柱,在试......
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