| 标准编号 | HJ 1000-2018 (HJ1000-2018) | | 中文名称 | 水质 细菌总数的测定 平皿计数法 | | 英文名称 | Water quality - Determination of total bacteria - Plate count method | | 行业 | 环保行业标准 | | 中标分类 | Z16 | | 字数估计 | 12,123 | | 发布日期 | 2018-12-26 | | 实施日期 | 2019-06-01 | | 标准依据 | 生态环境部公告2018年第73号 | | 发布机构 | 生态环境部 | HJ 1000-2018
Water quality-Determination of total bacteria-Plate count method
中华人民共和国国家环境保护标准
水质 细菌总数的测定 平皿计数法
2018-12-26 发布
2019-06-01 实施
生态环境部
目次
前言...ii
1 适用范围...1
2 规范性引用文件...1
3 术语和定义...1
4 方法原理...1
5 干扰和消除...1
6 试剂和材料...2
7 仪器和设备...2
8 样品...2
9 分析步骤...3
10 结果计算与表示...4
11 精密度和准确度...5
12 质量保证和质量控制...5
13 废物处理...6
附录 A（资料性附录） 细菌总数检验记录及报告推荐格式...7
前言
为贯彻《中华人民共和国环境保护法》 和《中华人民共和国水污染防治法》 ， 保护生态
环境， 保障人体健康， 规范水中细菌总数的测定方法， 制定本标准。
本标准规定了测定地表水、 地下水、 生活污水和工业废水中细菌总数的平皿计数法。
本标准的附录A为资料性附录。
本标准为首次发布。
本标准由生态环境部生态环境监测司、 法规与标准司组织制订。
本标准起草单位： 辽宁省环境监测实验中心。
本标准验证单位： 大连市环境监测中心、 丹东市环境监测中心站、 锦州市环境监测中心
站、 辽阳市环境监测站、 沈阳市疾病预防控制中心和辽宁北方环境检测技术有限公司。
本标准生态环境部2018年12月26日批准。
本标准自2019年6月1日起实施。
本标准由生态环境部解释。
水质 细菌总数的测定 平皿计数法
1 适用范围
本标准规定了测定水中细菌总数的平皿计数法。
本标准适用于地表水、 地下水、 生活污水和工业废水中细菌总数的测定。
2 规范性引用文件
本标准引用了下列文件或其中的条款。 凡是不注日期的引用文件， 其有效版本适用于本标准。
GB/T 14581 水质 湖泊和水库采样技术指导
HJ 494 水质 采样技术指导
HJ/T 91 地表水和污水监测技术规范
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。
3.1
细菌总数 total bacteria
36℃培养 48 h， 样品在营养琼脂上所生长的需氧菌和兼性厌氧菌菌落总数。
3.2
菌落形成单位 colony-forming units（CFU）
单位体积样品中的细菌群落总数。
4 方法原理
将样品接种于营养琼脂培养基中， 在特定的物理条件下（36℃培养 48 h） 培养， 生长的
需氧菌和兼性厌氧菌总数即为样品中细菌菌落的总数。
5 干扰和消除
5.1 活性氯具有氧化性， 能破坏微生物细胞内的酶活性， 导致细胞死亡， 可在样品采集（8.1）
时加入硫代硫酸钠溶液（6.5） 消除干扰。
5.2 重金属离子具有细胞毒性， 能破坏微生物细胞内的酶活性， 导致细胞死亡， 可在样品
采集（8.1） 时加入乙二胺四乙酸二钠溶液（6.6） 消除干扰。6 2
试剂和材料
除非另有说明， 分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂或生物试剂， 实验用水为蒸馏
水或去离子水。
6.1 营养琼脂培养基。
将上述成分或含有上述成分的市售成品溶解于1000 ml水中， 调节pH至7.4～7.6， 分装于
玻璃容器中， 经121℃高压蒸汽灭菌20 min， 储存于冷暗处备用。 避光、 干燥保存， 必要时
在5℃± 3℃冰箱中保存， 不得超过1个月。 配制好的营养琼脂培养基不能进行多次融化操作，
以少量勤配为宜。 当培养基颜色变化或脱水明显时应废弃不用。
6.2 无菌水： 取适量实验用水， 经 121℃高压蒸汽灭菌 20 min， 备用。
6.3 硫代硫酸钠（Na2S2O3·5H2O） 。
6.4 乙二胺四乙酸二钠（C10H14N2O8Na2·2H2O） 。
6.5 硫代硫酸钠溶液： （Na2S2O3） =0.10 g/ml
称取15.7 g硫代硫酸钠（6.3）， 溶于适量水中， 定容至100 ml， 临用现配。
6.6 乙二胺四乙酸二钠溶液： （C10H14N2O8Na2·2H2O） =0.15 g/ml
称取15 g乙二胺四乙酸二钠（6.4）， 溶于适量水中， 定容至100 ml， 此溶液可保存为30 d。
6.7 玻璃珠： 直径 3～8 mm。
7 仪器和设备
7.1 采样瓶： 250 ml 带螺旋帽或磨口塞的广口玻璃瓶。
7.2 高压蒸汽灭菌器： 115℃、 121℃可调。
7.3 恒温培养箱： 允许温度偏差 36℃± 1℃。
7.4 恒温水浴锅： 47℃可调。
7.5 pH 计： 准确到 0.1 pH 单位。
7.6 放大镜或菌落计数器。
7.7 一般实验室常用仪器和设备。
注： 玻璃器皿及采样器具试验前要按无菌操作要求包扎， 121℃高压蒸汽灭菌20 min备用。
8 样品
8.1 样品采集
点位布设及采样频次按照 GB/T 14581、 HJ/T 494 和 HJ/T 91 的相关规定执行。
采集微生物样品时， 采样瓶（7.1） 不得用样品洗涤， 采集样品于灭菌的采样瓶中。3
采集河流、 湖库等地表水样品时， 可握住瓶子下部直接将带塞采样瓶插入水中， 约距水
面 10～15 cm 处， 瓶口朝水流方向， 拔瓶塞， 使样品灌入瓶内然后盖上瓶塞， 将采样瓶从水
中取出。 如果没有水流， 可握住瓶子水平往前推。 采样量一般为采样瓶容量的 80%左右。
样品采集完毕后， 迅速扎上无菌包装纸。
从龙头装置采集样品时， 不要选用漏水龙头， 采水前将龙头打开至最大， 放水 3～5 min，
然后将龙头关闭， 用火焰灼烧约 3 min 灭菌或用 70%～75%的酒精对龙头进行消毒，
开足龙头， 再放水 1 min， 以充分除去水管中的滞留杂质。 采样时控制水流速度， 小心接入瓶内。
采集地表水、 废水样品及一定深度的样品时， 也可使用灭菌过的专用采样装置采样。
在同一采样点进行分层采样时， 应自上而下进行， 以免不同层次的搅扰。
如果采集的是含有活性氯的样品， 需在采样瓶灭菌前加入硫代硫酸钠溶液（6.5）， 以除
去活性氯对细菌的抑制作用（每 125 ml 容积加入 0.1 ml 硫代硫酸钠溶液）； 如果采集的是重
金属离子含量较高的样品， 则在采样瓶灭菌前加入乙二胺四乙酸二钠溶液（6.6），
以消除干扰（每 125 ml 容积加入 0.3 ml 乙二胺四乙酸二钠溶液）。
注： 15.7 mg 硫代硫酸钠（6.3） 可去除样品中 1.5 mg 活性氯， 硫代硫酸钠用量可根据样品实际活性氯量调整。
8.2 样品保存
采样后应在 2 h 内检测， 否则， 应 10℃以下冷藏但不得超过 6 h。 实验室接样后， 不能
立即开展检测的， 将样品于 4℃以下冷藏并在 2 h 内检测。
9 分析步骤
9.1 样品稀释
将样品用力振摇 20～25 次， 使可能存在的细菌凝团分散。 根据样品污染程度确定稀释
倍数。 以无菌操作方式吸取 10 ml 充分混匀的样品， 注入盛有 90 ml 无菌水（6.2） 的三角烧
瓶中（ 可放适量的玻璃珠）， 混匀成 1:10 稀释样品。 吸取 1:10 的稀释样品 10 ml 注入盛有
90 ml 无菌水的三角烧瓶中， 混匀成 1:100 稀释样品。 按同法依次稀释成 1:1000、 1:10000 稀
释样品。 每个样品至少应稀释 3 个适宜浓度。
注： 吸取不同浓度的稀释液时， 每次必须更换移液管。
9.2 接种
以无菌操作方式用 1 ml 灭菌的移液管吸取充分混匀的样品或稀释样品 1 ml， 注入灭菌
平皿中， 倾注 15～20 ml 冷却到 44～47℃的营养琼脂培养基（6.1）， 并立即旋摇平皿， 使样
品或稀释样品与培养基充分混匀。 每个样品或稀释样品倾注 2 个平皿。
9.3 培养
待平皿内的营养琼脂培养基冷却凝固后， 翻转平皿， 使底面向上（避免因表面水分凝结而影响细菌均匀生长），
在 36℃± 1℃条件下， 恒温培养箱（7.3） 内培养 48 h±2 h 后观察结果。
9.4 空白试验
用无菌水做实验室空白测定， 培养后平皿上不得有菌落生长， 否则， 该次样品测定结果
无效， 应查明原因后重新测定。
10 结果计算与表示
10.1 结果判读
平皿上有较大片状菌落且超过平皿的一半时， 该平皿不参加计数。
片状菌落不到平皿的一半， 而其余一半菌落分布又很均匀时， 将此分布均匀的菌落计数，
并乘以 2 代表全皿菌落总数。
外观（形态或颜色） 相似， 距离相近却不相触的菌落， 只要它们之间的距离不小于最小
菌落的直径， 予以计数。 紧密接触而外观相异的菌落， 予以计数。
10.2 结果计算
以每个平皿菌落的总数或平均数（同一稀释倍数两个重复平皿的平均数） 乘以稀释倍数
来计算 1 ml 样品中的细菌总数。 各种不同情况的计算方法如下：
优先选择平均菌落数在 30～300 之间的平皿进行计数， 当只有一个稀释倍数的平均菌落
数符合此范围时， 以该平均菌落数乘以其稀释倍数为细菌总数测定值（见表 1 例 1）。
若有两个稀释倍数平均菌落数在 30～300 之间， 计算二者的比值（二者分别乘以其稀释
倍数后， 较大值与较小值之比）。 若其比值小于 2， 以两者的平均数为细菌总数测定值； 若
大于或等于 2， 则以稀释倍数较小的菌落总数为细菌总数测定值（见表 1 例 2、 例 3、 例 4）。
若所有稀释倍数的平均菌落数均大于 300， 则以稀释倍数最大的平均菌落数乘以稀释倍
数为细菌总数测定值（见表 1 例 5）。
若所有稀释倍数的平均菌落数均小于 30， 则以稀释倍数最小的平均菌落数乘以稀释倍
数为细菌总数测定值（见表 1 例 6）。
若所有稀释倍数的平均菌落数均不在 30～300 之间， 则以最接近 300 或 30 的平均菌落
数乘以稀释倍数为细菌总数测定值（见表 1 例 7）。
表 1 稀释倍数选择及菌落总数测定值
10.3 结果表示
测定结果保留至整数位， 最多保留两位有效数字， 当测定结果≥100 CFU/ml 时， 以科
学计数法表示； 若未稀释的原液的平皿上无菌落生长， 则以“未检出” 或“＜1 CFU/ml” 表
示。 细菌总数检验记录及报告推荐格式参见附录 A。
11 精密度和准确度
11.1 精密度
6 个实验室分别对低浓度（地下水， 浓度均值为 39 CFU/ml）、 中浓度（地表水， 浓度均
值为 2.5× 103 CFU/ml） 和高浓度（生活污水， 浓度均值为 1.3× 105 CFU/ml） 三个不同浓度
细菌总数的样品及有证标准样品（浓度为 95 MPN/ml， 可接受范围为 22～168 MPN/ml） 进
行了 6 次重复测定： 实验室内相对标准偏差范围分别为 2.4%～6.2%、 0.6%～1.8%、 0.3%～
1.3%和 1.7%～5.6%； 实验室间相对标准偏差分别为 18%、 4.7%、 2.4%和 3.7%； 实验室间
95%置信区间见表 2。
表 2 实验室间 95%置信区间
12 质量保证和质量控制
12.1 培养基检验
更换不同批次培养基时要进行阳性菌株检验， 以......
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