| 标准编号 | HJ 1069-2019 (HJ1069-2019) | | 中文名称 | 水质 急性毒性的测定 斑马鱼卵法 | | 英文名称 | Water quality--Determination of the acute toxicity--Zebrafish (Danio rerio) eggs method | | 行业 | 环保行业标准 | | 中标分类 | Z16 | | 国际标准分类 | 13.060 | | 字数估计 | 23,225 | | 发布日期 | 2019 | | 实施日期 | 2020-06-30 | | 发布机构 | 生态环境部 | HJ 1069-2019: 水质 急性毒性的测定 斑马鱼卵法
HJ 1069-2019 英文名称: Water quality--Determination of the acute toxicity--Zebrafish (Danio rerio) eggs method
中华人民共和国国家环境保护标准
水质 急性毒性的测定 斑马鱼卵法
生 态 环 境 部 发 布
1 适用范围
本标准规定了测定水质急性毒性的斑马鱼卵法。
本标准适用于地表水、地下水、生活污水和工业废水的急性毒性测定。
2 规范性引用文件
本标准内容引用了下列文件中的条款。凡是不注日期的引用文件，其有效版本适用于本
标准。
4 方法原理
使用多孔细胞培养板，在微孔板对照、阴性对照和阳性对照控制的条件下，将 4-细胞
期～128-细胞期的斑马鱼受精卵置于不同稀释倍数的水样中，在 26℃±1℃的条件下培养 48
h，根据鱼卵存活与死亡的统计数据计算 LID 或 EC50值，表征水样的急性毒性。
5 干扰和消除
水样浊度或色度干扰测试终点判断，可用塑料滴管（7.11）缓慢从多孔细胞培养板（7.8）
中吸出一定量的水样后再行观测，避免触碰鱼卵；观测结束后，若需继续暴露，则用塑料滴
管（7.11）将原水样移回，恢复原有暴露体积。
6 试剂和材料
6.1 受试生物
6.1.1 种鱼
使用健壮、无疾病、无畸形、产卵量及受精率高的野生型斑马鱼作为种鱼用于产卵。成
鱼体长 3.5 cm左右，鱼龄在 6 月～24 月之间。健康雌鱼腹部银亮，饱满膨大。健康雄鱼体
型修长，腹部扁平，身体带有金黄色光泽。种鱼在产卵前 6 个月不予使用任何药物。种鱼驯
养及维持具体条件见附录 B。
6.1.2 鱼卵
确保试验鱼卵受精率≥70%，处于 4-细胞期～128-细胞期（见附录 A）。
6.2 试剂
除非另有说明，分析时使用符合国家标准的分析纯试剂。试验用水使用新制蒸馏水或去
离子水，满足 pH 值 6.5～8.5，电导率＜10 μS/cm的要求。
6.2.1 氢氧化钠（NaOH）。
6.2.2 氯化钙（CaCl2·2H2O）。
6.2.3 硫酸镁（MgSO4·7H2O）。
6.2.4 碳酸氢钠(NaHCO3)。
6.2.5 氯化钾（KCl）。
6.2.6 3,4-二氯苯胺（C6H5Cl2N），优级纯。
6.2.7 盐酸：ρ（HCl）=1.19 g/ml。
6.2.8 盐酸溶液：c（HCl）=0.1 mol/L。
量取 8.3 ml 盐酸（6.2.7），用水定容至 1 000 ml。
6.2.9 氢氧化钠溶液：c（NaOH）=0.1 mol/L。
称取 4 g 氢氧化钠（6.2.1），溶于少量水中，用水定容至 1 000 ml。
6.2.10 参比物质 3,4-二氯苯胺储备液：ρ（C6H5Cl2N）=100 mg/L。
称取 0.05 g 3,4-二氯苯胺（6.2.6），溶于少量标准稀释水（6.2.16）中，用标准稀释水
（6.2.16）定容至 500 ml，静置 24 h，调节 pH 值至 7.0。避光冷藏保存，储备液可储存 6 个
月。
6.2.11 参比物质 3,4-二氯苯胺工作液：ρ（C6H5Cl2N）=3.7 mg/L。
量取 3.7 ml 参比物质 3,4-二氯苯胺储备液（6.2.10），用溶解氧浓度达空气饱和值的标
准稀释水（6.2.16）定容至 100 ml，使用前按 8.2.1 步骤平衡至 26℃±1℃。该溶液作为阳性
对照，临用前现配。
6.2.12 氯化钙储备液：ρ（CaCl2·2H2O）=11.76 g/L。
称取 11.76 g 氯化钙（6.2.2），溶于少量水中，用水定容至 1 000 ml。可储存 6 个月。
6.2.13 硫酸镁储备液：ρ（MgSO4·7H2O）=4.93 g/L。
称取 4.93 g 硫酸镁（6.2.3），溶于少量水中，用水定容至 1 000 ml。可储存 6 个月。
6.2.14 碳酸氢钠储备液：ρ（NaHCO3）=2.52 g/L。
称取 2.52 g 碳酸氢钠（6.2.4），溶于少量水中，用水定容至 1 000 ml。可储存 6 个月。
6.2.15 氯化钾储备液：ρ（KCl）=0.22 g/L。
称取 0.22 g 氯化钾（6.2.5），溶于少量水中，用水定容至 1 000 ml。可储存 6 个月。
6.2.16 标准稀释水。
将氯化钙储备液（6.2.12）、硫酸镁储备液（6.2.13）、碳酸氢钠储备液（6.2.14）和氯
化钾储备液（6.2.15）四种储备液各 25 ml 混合，用水定容至 1 000 ml。
7 仪器和设备
7.1 冷藏采样箱：2℃～8℃；
7.2 pH 计：测量范围 0～14，最小分度为 0.1 pH 单位；
7.3 溶解氧测定仪：测量范围 0 mg/L～20 mg/L，最小分度为 0.1 mg/L；
7.4 倒置显微镜或体视显微镜：最小放大倍数为 30×；
7.5 冰箱：冷藏室 2℃～8℃；冷冻室≤-18℃；
7.6 恒温培养箱或恒温室：温度可调至 26℃±1℃；
7.7 斑马鱼养殖系统：包括净水、储水、供水、水质控制及循环等系统；
7.8 多孔细胞培养板：每孔容积 2.5 ml～5 ml 或采用其它相同功能的细胞培养板，可选择
市售；
7.9 产卵盒：惰性材料，推荐尺寸：20 cm×10 cm×11 cm（参见附录 C），可选择市售；
7.10 温度计：0℃～50℃；
7.11 塑料滴管：5 ml，口径大于 3 mm；
7.12 一般实验室常用器皿和设备。
8 样品
8.1 样品的采集和保存
根据样品性质及监测需要使用 1 000 ml 及以上容量的棕色玻璃瓶（或聚丙烯、聚四氟乙
烯、聚乙烯材质的容器）按照 HJ 91.1、HJ/T 91 或 HJ/T 164 的要求进行水样的采集，水样沿
瓶内壁缓慢倒入，并与瓶塞间不留空隙。
水样采集后，立即于 2℃～8℃避光运输和保存，并尽快进行试验，保存时间最长不超
过 48 h。水样若需长期保存，则上述水样采集后应尽快送回实验室冷冻（≤-18℃）保存，
保存前将水样充分混匀后按每 1000 ml 容器盛装 500 ml～700 ml 水样的量分装，保存期不超
过 2 个月。
8.2 样品预处理
8.2.1 温度
冷冻保存的水样需在不超过 25℃水浴轻微振荡解冻，或在 2℃～8℃冷藏过夜解冻。受
试水样在试验开始前，放置于恒温培养箱或恒温室（7.6）中，26℃±1℃避光平衡至恒温后
用于试验。
8.2.2 pH值
按照 GB/T 6920 方法测定水样 pH 值。当 pH 值＜6.5 或 pH 值＞8.5 时，使用盐酸溶液
（6.2.8）或氢氧化钠溶液（6.2.9）调节水样 pH 值至 6.5～8.5，尽量减少酸碱调节液的用量，
以减少对水样浓度的影响。测定并记录调节后的水样 pH 值，按后续步骤进行水样测定。
当 pH 值的影响需要反映在试验结果中或者调节 pH 值会引起水样物理变性或化学反应
时，则不调节水样 pH 值。
根据水样测定的实际需求，也可对 pH 值调节前后的水样同时开展试验比较。
8.2.3 溶解氧
按照 HJ 506 方法测定水样溶解氧浓度，确保用于暴露试验（9.3）步骤中的每个稀释水
样中初始溶解氧浓度不低于 4 mg/L（大约 50%饱和度）。若要充氧，溶解氧浓度不超过相应
饱和溶解氧值。
8.3 样品稀释
8.3.1 预实验
当浓度难以预估时需进行预试验，以稀释比为 10 选择 3 个连续浓度的稀释水样，每一
浓度以 5 粒鱼卵按 9.3～9.6 部分进行试验，以确定鱼卵死亡率 100%～0%与稀释水样浓度大
致对应的范围。
8.3.2 测定 LID时稀释
为保证最高稀释倍数水样鱼卵存活率≥90%、最低稀释倍数水样鱼卵存活率尽可能＜
90%，一般选择连续的 4 个～5 个（鱼卵存活率与水样浓度的大致对应关系已知时选 2 个～
3 个）稀释倍数水样，水样的稀释参照表 1。
8.3.3 测定 EC50时稀释
为保证稀释水样最大浓度的死亡率为 100%或与之接近，稀释水样最小浓度的死亡率为
0%或与之接近，一般按一定稀释比（一般≤2）选择 5 个连续浓度的稀释水样。
以上用于样品稀释的标准稀释水，稀释前应按 8.2.1 步骤平衡水温至 26℃±1℃并用空
气曝气至溶解氧浓度达到空气饱和值。
9 试验步骤
9.1 配种
试验前一天傍晚开始斑马鱼种鱼（6.1.1）配种，将洗净晾干后的产卵盒（7.9）内缸套入
外缸，插入隔板，加入约 2/3 缸标准稀释水（6.2.16），选取体长及鱼龄相当、性发育特征明
显、健康活跃的雌雄种鱼，在左右两个隔间中分别加入 1 尾雌鱼和 2 尾雄鱼，盖上盖板，于
恒温培养箱或恒温室（7.6）中避光放置过夜。
按以上步骤至少进行 3 组种鱼的配种。
9.2 产卵及鱼卵初筛
次日光照开始后，打开产卵盒（7.9）盖板，提取内缸，弃去外缸内的水后再放回内缸，
沿内缸壁小心加入标准稀释水（6.2.16），以水面距内缸底部约 2 个种鱼体宽为宜，避免伤
害种鱼。抽开隔板，让雌雄种鱼交配产卵，30 min 后检查各缸种鱼产卵情况，分别收集已产
卵各缸内相应鱼卵，用标准稀释水（6.2.16）冲洗至结晶皿中，在恒温培养箱或恒温室（7.6）
中静置 45 min 后，结晶皿以黑底相衬，侧面加以灯光观察，每个结晶皿中随机选取鱼卵 20
粒按照附录 D.1 的方法识别受精鱼卵，避免伤害鱼卵。统计每组种鱼所产鱼卵的受精率，至
少选取受精率≥70%的 3 组鱼卵混合备用。
9.3 暴露试验
将已配制好的不同浓度的稀释水样按附录 E 设置的试验布局加至多孔细胞培养板（7.8），
每孔 2 ml。
上述稀释水样各取 60 ml～70 ml 于不同的培养皿中，用塑料滴管（7.11）在备用鱼卵中
各取圆润、饱满、完整的 20 粒加入上述培养皿中，将各培养皿在倒置显微镜或体视显微镜
（7.4）下逐一进行观测，选取 4-细胞期～128-细胞期（参见附录 A）的受精卵，去除在细胞
分裂时有明显异常（如不对称、有囊泡或无卵膜等）或者卵膜损伤的鱼卵。在已加入水样的
多孔细胞培养板（7.8）对应孔中各加入 1 粒受精卵，盖上盖板。
以上操作过程应在鱼卵（9.2）静置 45 min 后 60 min 内完成。
将上述多孔细胞培养板（7.8）于恒温培养箱或恒温室（7.6）中，按附录 B 的水温和光
照条件进行 48 h 暴露试验。
9.4 鱼卵镜检判定测试终点
以卵凝结、体节未形成、尾部未分离及无心跳为测试终点，判定方法如下（参见附录 D.2）：
a）卵凝结
凝结的鱼卵显微镜下内含物完全不透明，质地较硬。在肉眼观察下凝结的鱼卵呈不透明
及灰暗的状态。
b）体节未形成
鱼卵卵黄囊外侧胚胎中后部，无体节者为体节未形成。
c）尾部未分离
正常发育的鱼卵，胚胎的尾部会伸长，与卵黄囊相分离。若无，则表明尾部未分离。若
48 h 后，胚胎尾部分离程度与 24 h 时相比未有明显变化，同样也判定为尾部未分离。
d）无心跳
斑马鱼卵胚胎心脏位于卵黄囊与胚胎头部间，观测该区域是否有节律的震动，若无，则
表明无心跳。
将上述暴露试验的多孔细胞培养板（7.8）置于倒置显微镜或体视显微镜（7.4）下按表
2 要求进行鱼卵镜检。
鱼卵暴露 24 h 和 48 h 后，出现任一测试终点情况则判定鱼卵死亡，统计每一稀释水样
鱼卵的存活率和死亡率。
9.5 对照试验
每批水样试验时，按附录 E 试验布局及 9 步骤进行对照试验。
a）微孔板对照
以标准稀释水（6.2.16）为水样进行微孔板对照试验。
b）阴性对照
以标准稀释水（6.2.16）为水样进行阴性对照试验。
c）阳性对照
以 3,4-二氯苯胺工作液（6.2.11）为水样进行阳性对照试验。
以上 9 试验步骤均使用标准稀释水（6.2.16）用于配种（9.1）、产卵及鱼卵初筛（9.2）、
微孔板对照和阴性对照试验（9.5），应按 8.2.1 步骤平衡水温至 26℃±1℃，并用空气曝气至
溶解氧浓度至少达到空气饱和值的 80%。所涉实验室温度控制在 26℃左右，恒温培养箱或
恒温室（7.6）温度控制在 26℃±1℃。
10 结果计算与表示
鱼卵存活率在 90%及以上的最低稀释倍数，即为最低无效应稀释倍数 LID。LID 的结果
应为整数，如 LID=2。
水样 EC50可按附录 G 方法计算，也可采用概率单位法、直线内插法等其他方法来计算。
结果保留至小数点后 1 位。
11 有效性、敏感性与精密度
11.1 有效性及敏感性
六家实验室对阴性对照水样（6.2.16 标准稀释水）进行了 6 次重复测定：存活率介于
90%～100%。
六家实验室对阳性对照水样（6.2.11 参比物质 3,4-二氯苯胺工作液）进行了 6 次重复测
定：死亡率介于 40%～60%。
11.2 精密度
六家实验室分别对阴性对照水样（6.2.16 标准稀释水）、ρ=1.3 mg/L、ρ=3.7 mg/L、
ρ=6.3 mg/L 的低、中、高三个浓度水样（用阳性参比物质 3,4-二氯苯胺配制）进行了斑马鱼
卵急性毒性的测定，每个水样平均测定 6 次：前三者鱼卵存活率实验室内相......
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