| 标准编号 | SN/T 2622-2019 (SN/T2622-2019) | | 中文名称 | 柑桔溃疡病菌检疫鉴定方法 | | 英文名称 | Detection and identification of Xanthomonas axonopodis pv.citri | | 行业 | 商检行业标准 (推荐) | | 中标分类 | B16 | | 国际标准分类 | | | 字数估计 | 12,156 | | 发布日期 | 2019-09-03 | | 实施日期 | 2020-03-01 | | 旧标准 (被替代) | SN/T 2622-2010 | | 标准依据 | 海关总署公告2019年第142号 | | 发布机构 | 海关总署 | SN/T 2622-2019: 柑桔溃疡病菌检疫鉴定方法
SN/T 2622-2019 英文名称: Detection and identification of Xanthomonas axonopodis pv.citri
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN／T２６２２-２０１９代替ＳＮ/T ２６２２-２０１０
柑桔溃疡病菌检疫鉴定方法
中华人民共和国海关总署 发 布
前言
本标准按照GB/T １．１-２００９给出的规则编写。
本标准代替ＳＮ/T ２６２２-２０１０《柑桔溃疡病菌检疫鉴定方法》，与ＳＮ/T ２６２２-２０１０相比主要变化
如下：
---对原标准柑桔溃疡病菌检疫鉴定判定程序进行了修订；
---补充了柑桔溃疡病菌图片资料；
---补充了柑桔溃疡病菌荧光实时ＰＣＲ检测方法等更多可选择的ＰＣＲ方法；
---补充了柑桔溃疡病菌致病性测定反应。
本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。
本标准起草单位：中华人民共和国成都海关、中华人民共和国上海海关。
本标准主要起草人：向勇、陈玲玲、付景圆、易建平、邵宝林、何万兴、王成华。
本标准代替标准的历次发布版本为：
柑桔溃疡病菌检疫鉴定方法
１ 范围
本标准规定了进出境植物检疫中柑桔溃疡病菌的检疫鉴定方法。
本标准适用于进出境芸香科（Ｒｕｔａｃｅａｅ）植物及其果实中柑桔溃疡病菌的检疫鉴定。
２ 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本
文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T ６６８２ 实验室用水规格和试验方法
ＳＮ/T １１５７ 进出境植物苗木检疫规程
ＳＮ/T ２１２２ 进出境植物及植物产品检疫抽样
３ 病菌的基本信息
４ 方法原理
该病菌的为害症状、菌落形态特性、致病性反应、ＰＣＲ特异性反应是其检疫鉴定的主要依据。
５ 主要试剂
除另有说明，本标准中试剂均为分析纯或生化试剂，试验用水参照GB/T ６６８２。
７０％乙醇、蛋白胨、牛肉浸膏、酵母膏、蔗糖、琼脂、溴化乙锭（ＥＢ）、琼脂糖、ＤＮＡＭａｒｋｅｒ、ＴａｑＤＮＡ聚合酶、ＰＣＲ体系、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ、ＴａｑＭａｎ探针等。
６ 仪器设备
体式显微镜、超挣工作台、高压灭菌锅、生物培养箱、电子天平、普通冰箱、超低温冰箱、离心机、涡旋
混匀仪、纯水仪、浊度计、ＰＣＲ仪、实时荧光ＰＣＲ仪、电泳仪、凝胶成像系统、微量可调加样器、剪刀、培
养皿、三角瓶。
７ 检疫鉴定
７．１ 检疫鉴定流程
柑桔溃疡病菌鉴定流程如图１所示。
７．２ 症状检查
按照ＳＮ/T １１５７和ＳＮ/T ２１２２中规定的程序进行现场检疫并抽取样品。实验室对样品进行症状
检查，观察待检样品是否带有疑似症状（参见附录Ａ），如有症状，切取症状处组织在显微镜下观察是否
有喷菌现象，如有喷菌，直接从喷菌组织分离病菌。
如样品无症或有症样品未见喷菌，进行ＰＣＲ初检，ＰＣＲ方法见附录Ｂ。ＰＣＲ结果为阳性的样品再
进行病菌分离。
７．３ PCR检测
取无症样品或未见喷菌的有症样品，灭菌生理盐水室温浸泡处理３０ｍｉｎ或４℃冰箱过夜，震荡，取
浸泡液１００００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，沉淀提取ＤＮＡ。常规ＰＣＲ或实时荧光ＰＣＲ检测（附录Ｂ），柑桔溃
疡病菌ＤＮＡ作为阳性对照，非柑桔溃疡病菌ＤＮＡ作为阴性对照，双蒸水作为空白对照。
７．４ 病菌分离
有症样品症状处切取２ｍｍ×２ｍｍ小块组织，制片后于显微镜１０×～２０×倍下观察切口处是否
有云雾状细菌从切口处喷出。每个样品切取５～１０个小块组织观察喷菌，分离其中有喷菌的３～５个小
块组织，如不足３个喷菌组织，可增加镜检的组织数量。如有喷菌，将喷菌组织块取出，无菌水冲洗一
次，７０％酒精表面消毒处理３０ｓ～６０ｓ，无菌水冲洗三次，转入１００μＬ无菌水中浸泡１５ｍｉｎ；处理液于ＮＡ平板上划线分离，每个处理划线３个～５个平板；２８℃培养２ｄ～４ｄ后观察是否有典型菌落。疑似
菌落纯化三次后进行下一步鉴定试验。
如有症样品未观察到喷菌现象，取症状处组织剪刀剪成２ｍｍ见方小块，加入适量灭菌水中室温浸
泡３０ｍｉｎ或４℃冰箱过夜，取一半处理液１００００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，沉淀提取ＤＮＡ，常规ＰＣＲ或实时
荧光ＰＣＲ初检。阳性样品处理液稀释１０×、１００×和１０００×，分别取１００μＬ涂布ＮＡ平板，每个处理涂布５个～１０个平板。培养和观察方法同上。如ＰＣＲ阳性样品未分离出典型菌落，可增加样本重复，
或处理液不稀释直接涂布平板，观察培养情况。
无症样品的初检和分离参考本方法。
７．５ 鉴定
７．５．１ 菌落形态特征
ＮＡ培养基上菌落平滑，不透明，有光泽，圆形，凸起，边缘完整；初始为白色，后变为浅黄色；ＮＢＹ
培养基上的菌落浅黄色，圆形，凸起，粘液状；ＰＳＡ培养基上菌落浅黄色，粘液状，有光泽。挑取可疑菌
落在ＮＡ培养基平板上纯化三次后进行ｂｉｏｌｏｇ测定或ＰＣＲ鉴定。
病菌生理生化特征见附录Ａ。
７．５．２ PCR扩增
疑似分离物在ＮＡ平板上２８℃培养４８ｈ，收集菌体提取ＤＮＡ，进行常规ＰＣＲ或实时荧光ＰＣＲ检
测，检测程序见附录Ｂ。
７．５．３ 致病性测定
疑似分离物在ＮＡ上２８℃培养４８ｈ，用无菌水配成１０８ＣＦＵ／ｍＬ菌悬液，采用针刺接种法接种柑桔（葡
萄柚、墨西哥来檬、枸桔和甜橙）幼嫩叶片，以无菌水作为阴性对照。接种植株２８℃培养，７ｄ后开始观察叶片
发病情况。对接种出现症状处组织进行病菌再分离，并与最初的接种分离物比较，完成致病性测试。
８ 结果评定
分离获得疑似分离物，ｂｉｏｌｏｇ测定符合或ＰＣＲ检测结果为阳性，致病性测试表现典型症状，判定样
品为检出柑桔溃疡病菌；其余情况判定为未检出柑桔......
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