路径: 主页 > SN/T > 第24页 > SN/T 2641-2010 | 标准编号 | SN/T 2641-2010 (SN/T2641-2010) | | 中文名称 | 食品中常见致病菌检测 PCR-DHPLC法 | | 英文名称 | Detection of pathogen in food - PCR-DHPLC method | | 行业 | 商检行业标准 (推荐) | | 中标分类 | X04 | | 国际标准分类 | 07.100.30 | | 字数估计 | 13,128 | | 发布日期 | 2010-11-01 | | 实施日期 | 2011-05-01 | | 引用标准 | GB/T 6682; GB 19489; GB/T 27403 | | 标准依据 | National Quality Inspection (2010) 582 | | 发布机构 | 海关总署 | | 范围 | 本标准规定了食品中沙门氏菌等30种致病菌的PCR DHPLC检测方法。本标准适用于食品中沙门氏菌等30种致病菌的快速检测。注:30种常见致病菌包括:沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森菌、单核细胞增生李斯特氏菌, 空肠弯曲菌, 嗜热弯曲菌、肠出血性大肠埃希氏O157 | SN/T 2641-2010: 食品中常见致病菌检测 PCR-DHPLC法
SN/T 2641-2010 英文名称: Detection of pathogen in food - PCR-DHPLC method
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T 2641-2010
食品中常见致病菌检测
PCR-DHPLC 法
中华人民共和国发布
国家质量监督检验检疫总局
1 范围
本标准规定了食品中沙门氏菌等30种致病菌的PCR-DHPLC检测方法。本标准适用于食品中沙门氏菌等30种致病菌的快速检测。
注：30种常见致病菌包括：沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、空肠弯曲菌、嗜热弯曲菌、肠出血性大肠埃希氏菌O157:H7、产肠毒素大肠埃希氏菌、肠致病性大肠埃希氏菌、肠慢袭性大肠埃希氏菌、阪崎肠杆菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、河流弧菌、梅氏弧菌、嗜水气单胞菌、肉毒梭菌、产气荚膜梭菌、蜡样芽孢杆菌、溶血性链球菌、布鲁氏杆菌、乳酸杆菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯氏菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489 实验室 生物安全通用要求
GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测
3 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
DNA(deoxyribonuleic acid):脱氧核糖核酸
dNTP(deoxyribonucleoside triphosphate):脱氧核苷酸三磷酸
DHPLC(denaturing high performance liquid chromatography):变性高效液相色谱PCR(polymerase chain reaction):聚合酶链式反应Taq(Thermus aquaticu):水生栖热菌TEAA:三乙基铵醋酸盐
4 生物安全措施
为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测致病菌，所有培养物应小心处置。应按照GB19489中的有关规定执行。
5 废弃物处理和防止污染的措施
5.1 检测过程中的废弃物需经121℃高压灭菌处理至少30 min后再弃置。
5.2检测过程中防止交叉污染的措施参照标准GB/T 27403执行。
6原理
DHPLC分析技术是应用离子对反相液相色谱原理对DNA片段进行分离。离子对采用三乙基胺醋酸盐缓冲溶液(TEAA),核苷酸片段分子中带负电荷的磷酸根基团与TEAA分子中带正电荷的氨基发生静电作用相互吸引，同时TEAA分子中的三个乙基与固定相C₁s表面的烷基发生疏水作用力而相互吸引，通过流动相中的乙腈的梯度洗脱达到将不同大小的核苷酸片段分离。
7 试剂和材料
除另有规定外，所有试剂纯用应为色谱纯。水为灭菌超纯水，符合GB/T 6682中一级水的规格。所有试剂均用无DNA酶污染的
7.1 Tag DNA聚合酶。
7.2 dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP。
7.310×PCR缓冲液：200 mmol/L Tris-HCl(pH8.4),200mmol/L氯化钾，15mmol/L氯化镁。
7.4 引物：引物序列见附录表A.1。
7.5 TE溶液。
7.6 10% SDS,
7.7蛋白酶K(20mg/mL)。
7.8氯化钠(NaCl):5 mol/L和0.7mol/L
7.910% CTAB。
7.10 三氯甲烷，
7.11 异戊醇。
7.12 酚。
7.13异丙醇。
7.14 70%乙醇
7.15 DHPLC缓冲液：缓冲溶A为50ml TEAA和250uL乙腈混合，加水定容至1000mL;缓冲溶液B为50mLTEAA和250ml加乙腈混合,加水定容至1000mL,缓冲溶液D为75%乙腈。
8 主要仪器和设备
8.1 PCR仪。
8.2 DHPLC仪。
8.3高速离心机：离心转速18000g。
8.4 PCR超净工作台。
8.5微量可调移液器和灭菌吸头：2μL、10μL、100μL、200μL、1000μL。
8.6 灭菌PCR反应管。
9 方法提要与检测程序
9.1 方法提要
本方法利用DHPLC非变性条件下的DNA分离技术，灵敏地检测PCR扩增产物进行细菌鉴定分析，不同的细菌显示特异的DHPLC吸收峰，从而对食品中的致病菌进行快速检测。
9.2 检测流程
致病菌PCR-DHPLC检测流程见图1。
样品制备
增菌肉汤或待鉴定的凿株
细菌DNA的提取
阴性
图1变性高效液相色谱法检测致病菌流程图
10 操作步骤
10.1 样品制备、增菌培养和分离
参照附录B中的相关国家标准、行业标准或国际权威标准方法进行增菌和分离培养。
10.2 模板DNA的制备
10.2.1 增菌液模板DNA的制备
取10.1中培养的相应致病菌增菌液(需二次培养的则取二次增菌液)1.5mL,加到1.5mL无菌离心管中，13000g离心1min;吸弃上清液，取沉淀，加567μLTE溶液(pH8.0),悬浮，加30μL10% SDS和3μL蛋白酶K(20mg/mL),混匀，37℃温浴1h;加100μL氯化钠(5 mol/L),混匀，加80μL CTAB/NaCl溶液(10% CTAB和0.7 mol/L氯化钠),混匀，65℃温浴10 min;加等体积三氯甲烷/异戊醇(体
积比为24:1),混匀，13000g离心10min;取上清液，加等体积酚/三氯甲烷/异戊醇(体积比为25:24:1),混匀，13000g离心10 min;取上清液，加0.6倍体积异丙醇，轻轻混匀，13000g离心10min;取沉淀，用70%乙醇清洗2次，干燥，加100μLTE溶液(pH8.0)溶解，此即为DNA溶液。若不能立即检测，可保存于一20℃备用。按同样方法制备阳性对照菌株和阴性对照菌株的增菌液模板
DNA。也可使用商业化的DNA提取试剂盒并按其说明制备模板DNA。
10.2.2 可疑菌落模板DNA的制备
挑取10.1中分离到的可疑菌落或菌体，或其传代培养液1.5mL,按照10.2.1步骤制备模板DNA以待检测。也可使用商业化的DNA提取试剂盒并按其说明制备模板DNA。
10.3 PCR扩增
10.3.1反应体系体积为25μL:10×PCR缓冲液2μL、正义引物和反义引物(10 μmol/L)各1μL、dNTP(10 mmol/L)2μL、Tag DNA聚合酶(5U/μL)0.2μL、水16.8μL、模板DNA(10ng/μL～50ng/
μL)2μL。
10.3.2 反应条件：94℃预变性3min;94℃变性60s,60℃退火60s,72℃延伸60s,进行35个循环；72℃延伸7min,4℃保存反应产物。
10.3.3将PCR产物进行DHPLC分析。注：PCR反应参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当的调整。
10.4 DHPLC检测
10.4.1 DHPLC分析条件
DHPLC分析条件如下：
a)色谱柱：PS-DVB&C₁₅DNASep色谱柱(4.6mm×50mm,粒度3μm);
b)柱温：50℃;
c)流动相：缓冲溶液A浓度为50.2%,缓冲溶液B浓度为49.8%;
d) 流速：0.9mL/min;
e) 分析片断设计：起始碱基数：扩增目标的预期片段减去100 bp;终止碱基数：扩增目标的预期片段加上100 bp;
f) 检测器：荧光检测器(光源：150W Xenon灯；激发谱带宽：15nm;发射谱带宽：15.3nm;检测灵敏度：在波长350nm积分2s);
g)上样量：PCR产物5μL～10μL。
10.4.2 DHPLC分析步骤
10.4.2.1 将装有PCR产物的反应管放置在DHPLC金属板的微孔中。
10.4.2.2 登录DHPLC分析系统，按照10.4.1设置DHPLC分析条件，建立检测程序并运行。
10.5 质控对照设置
检测过程中应分别设阳性对照和阴性对照。阳性对照为目标致病菌的标准菌株，阴性对照为非目标致病菌的标准菌株。
11 结果及判断
11.1 质控标准
11.1.1 阴性对照：无吸收峰出现。
11.1.2 阳性对照：出现典型的PCR产物吸收峰，且峰吸收值大于3mV。
11.1.3不符合上述对照质控标准的视为无效。
11.2 结果判定和报告
以沙门氏菌为例，DHPLC检测图谱示例，参见附录C:
a)检测样品无扩增吸收峰出现，可判定样品结果为阴性，直接报告未检出×××致病菌；
......
|