SN/T 5108-2019 相关标准英文版PDF
| 标准号码 | 价格美元 | 第2步(购买) | 交付天数 | 标准名称 |
| SN/T 5108-2019 | 179 | SN/T 5108-2019 | [PDF]天数 <=3 | 国境口岸轮状病毒、星状病毒、诺如病毒、札如病毒四联HRMA检测方法 |
| 基本信息 | |
|---|---|
| 标准编号 | SN/T 5108-2019 (SN/T5108-2019) |
| 中文名称 | 国境口岸轮状病毒、星状病毒、诺如病毒、札如病毒四联HRMA检测方法 |
| 英文名称 | (Method for detecting HRMA of rotavirus, astrovirus, norovirus and Zaru virus in border port) |
| 行业 | 商检行业标准 (推荐) |
| 中标分类 | C62 |
| 国际标准分类 | |
| 字数估计 | 8,818 |
| 发布日期 | 2019-09-03 |
| 实施日期 | 2020-03-01 |
| 标准依据 | 海关总署公告2019年第142号 |
| 发布机构 | 海关总署 |
SN/T 5108-2019: 国境口岸轮状病毒、星状病毒、诺如病毒、札如病毒四联HRMA检测方法
SN/T 5108-2019 英文名称: (Method for detecting HRMA of rotavirus, astrovirus, norovirus and Zaru virus in border port)
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
国境口岸轮状病毒、星状病毒、诺如病毒、
札如病毒四联HRMA检测方法
中华人民共和国海关总署 发 布
前言
本标准按照GB/T １．１-２００９给出的规则起草。
本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。
本标准起草单位：中华人民共和国拱北海关，深圳市计量质量检测研究院。
本标准主要起草人：汪海波、莫秋华、杨泽、兰全学、杨国武、史咏梅、涂承宁、林继灿。
国境口岸轮状病毒、星状病毒、
诺如病毒、札如病毒四联HRMA检测方法
１ 范围
本标准规定了国境口岸轮状病毒、星状病毒、诺如病毒和札如病毒这四种病毒的检验对象、方法、结
果报告、生物安全要求及阳性结果判定。
本标准适用于入出境人员携带轮状病毒、星状病毒、诺如病毒、札如病毒的实验室检测。
２ 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB １９４８９ 实验室生物安全通用要求
ＷＳ/T ２３０ 临床诊断中聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术的应用
ＳＮ/T １１９３ 基因检验实验室技术要求
ＳＮ/T １７２０ 出入境口岸轮状病毒感染监测规程
人间传染的病原微生物名录（中华人民共和国卫生部２００６年制定）
４ 缩略语
下列缩略语适用于本文件：
---ｂｐ：ｂａｓｅｐａｉｒ，碱基对；
---ＤＥＰＣ：ｄｉｅｔｈｙｌｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ，焦碳酸乙二酯；
---ＨＲＭＡ：ｈｉｇｈｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｍｅｌｔｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓ，高分辨率熔解曲线分析；
---ＰＡＧＥ：ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，聚丙烯酰胺凝胶电泳。
５ 检测对象
５．１ 出入境口岸发现的有呕吐、腹泻和发热等症状疑似腹泻病毒感染的急性肠胃炎病人。
５．２ 其他申请检验的人员。
６ 生物安全和PCR防污染要求
实验室生物安全应符合GB １９４８９的规定。按照《人间传染的病原微生物名录》，这四种病毒的危
害程度均为第三类，可在生物安全二级实验室进行相关操作。ＰＣＲ 防污染措施按 ＷＳ/T ２３０和
ＳＮ/T １１９３的规定执行。
７ 主要仪器
本方法所用的主要仪器如下：
---二级生物安全柜；
---台式高速冷冻离心机（最高离心力１２０００ｒｐｍ以上）；
---旋涡振荡器；
---冰箱：４℃、-２０℃和-７０℃；
---超净工作台；
---微型离心机；
---Ｒｏｔｏｒ-ＧｅｎｅＱＰＣＲ热循环仪（带高分辨率熔解曲线分析模块）；
注：给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可和推荐。如果其他等效产品具有相同的
效果，则可使用这些等效产品。
---微波炉；
---高压灭菌锅；
---超纯水器或双蒸水器；
---微量可调移液器一套（含以下５种规格：２．５μＬ、２０μＬ、１００μＬ、２００μＬ、１ｍＬ）。
８ 主要试剂
８．１ 无ＲＮＡ酶的ＤＥＰＣ水。
８．２ ＲＴ-ＰＣＲ引物应为ＰＡＧＥ以上级别纯化，引物序列见９．２．３．１。
８．３ ＲＴ-ＰＣＲ基础试剂：宝生物工程（大连）有限公司ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＯｎｅＳｔｅｐＲＴ-ＰＣＲＫｉｔ。
注：给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可和推荐。如果其他等效产品具有相同的
效果，则可使用这些等效产品。
８．４ ＥｖａＧｒｅｅｎ荧光染料。
９ 检验程序
９．１ 样品采集
粪便标本和呕吐物标本的采集按照ＳＮ/T １７２０执行。
９．２ 实验室检验
９．２．１ 样品预处理
取黄豆大小约１００ｍｇ的粪便标本或呕吐物，或１００μＬ水样便，加入９００μＬ的生理盐水，剧烈振荡混匀，制成１０％的悬液；然后４℃，８０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ；转移上清至灭菌的干净离心管。不能立即
进行检测时，样本冻存于-７０℃超低温冰箱备用。
９．２．２ 病毒核酸提取
取９．２．１预处理好的样本１００μＬ，加入１ｍＬＴｒｉｚｏｌ液，振荡混匀后室温静置５ｍｉｎ，然后加入２００μＬ氯仿，盖紧离心管，用手剧烈振荡混匀１５ｓｅｃ后室温静置５ｍｉｎ，４℃，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上层水相至另一离心管中，加入５００μＬ 异丙醇沉淀 ＲＮＡ，充分混匀后室温放置 １０ ｍｉｎ，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，弃上清液，再加入１ｍＬ的７０％乙醇洗涤一次，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃
上清液，室温放置５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ后加入５０μＬＤＥＰＣ水（或其他核酸溶解液）溶解核酸沉淀，分装后于-７０℃条件下保存，备用。
９．２．２．２ 试剂盒提取核酸法
按适用于病毒基因组提取的商品试剂盒说明书操作。
９．２．３ 四重高分辨率熔解曲线检测
９．２．３．１ 引物
引物序列分别见表１。
９．２．３．２ 标准品、阳性对照、阴性对照和空白对照设置
检测过程中分别设标准品、阳性对照、阴性对照和空白对照。标准品为克隆的轮状病毒、星状病毒、
诺如病毒和札如病毒部分核苷酸序列（必须包含扩增区域在内）在体外转录合成的ＲＮＡ；阳性对照为留
存的这４种病毒的阳性样本的核酸或体外转录合成的ＲＮＡ；阴性对照为正常人大便提取的核酸；空白
对照为无菌水。
９．２．３．３ 反应体系组成
反应体系组成见表２。
９．２．３．４ 反应条件
反应条件为：４２℃ 反转录５ｍｉｎ；９５℃预变性１０ｓｅｃ；９５℃变性１０ｓｅｃ，６０℃退火／延伸３０ｓｅｃ，４０
个循环；设置温度从６５℃逐渐上升至９５℃，上升速率为０．１℃／ｃｙｃｌｅ。因不同ＰＣＲ仪器的性能差异，
可根据条件优化适当调整反应条件。
９．２．３．５ 高分辨率熔解曲线分析
用仪器自带的软件对生成的熔解曲线进行分析，将阳性对照／阴性对照／空白对照／样本的熔解曲线
同标准品的熔解曲线进行对比。阳性样本的曲线为典型的单一尖峰，而阴性样本的曲线为均一直线，无
熔解峰。
９．２．４ 检验结果判断及报告
当阳性对照的熔解曲线同各标准品的一致，而阴性对照／空白对照的为均一直线时才可对样本进行
结果判断及报告，否则视为实验失败，需重新实验。本标准检验结果判断及报告如下：
ａ） 检验样品的熔解曲线同轮状病毒标准品的一致，报告“检出轮状病毒特异性基因（ＨＲＭＡ
法）”；
ｂ） 检验样品的熔解曲线同星状病毒标准品的一致，报告“检出星状病......