| 标准编号 | SN/T 5109-2019 (SN/T5109-2019) | | 中文名称 | 国境口岸鼠疫耶尔森菌聚合酶螺旋恒温扩增检测方法 | | 英文名称 | (Method for detection of Yersinia tyrosin polymerase spiral constant temperature amplification in border ports) | | 行业 | 商检行业标准 (推荐) | | 中标分类 | C62 | | 国际标准分类 | | | 字数估计 | 13,143 | | 发布日期 | 2019-09-03 | | 实施日期 | 2020-03-01 | | 标准依据 | 海关总署公告2019年第142号 | | 发布机构 | 海关总署 | SN/T 5109-2019: 国境口岸鼠疫耶尔森菌聚合酶螺旋恒温扩增检测方法
SN/T 5109-2019 英文名称: (Method for detection of Yersinia tyrosin polymerase spiral constant temperature amplification in border ports)
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
国境口岸鼠疫耶尔森菌聚合酶螺旋
恒温扩增检测方法
中华人民共和国海关总署 发 布
前言
本标准根据GB/T １．１-２００９给出的规则起草。
本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。
本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国满洲里海关、中华人民共和国福州海
关、中国人民解放军疾病预防控制研究所。
本标准主要起草人：张晓龙、高艳菲、郭文秀、王静、黄恩炯、刘威、慈颖、刘丽娟、杨宇、黄留玉。
国境口岸鼠疫耶尔森菌聚合酶螺旋
恒温扩增检测方法
１ 范围
本标准规定了国境口岸检测鼠疫耶尔森菌聚合酶螺旋恒温扩增（ＰＳＲ）法，包括样本前处理、检测程
序、方法、结果判定及报告。
本标准适用于国境口岸鼠疫耶尔森菌疑似感染样本、啮齿动物、蚤等样本中鼠疫耶尔森菌的筛选
检测。
２ 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB １９４８９ 实验室生物安全通用要求
ＷＳ２３３ 微生物和生物医学实验室生物安全通用准则
人间传染的病原微生物名录（中华人民共和国卫生部）
４ 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
ＰＳＲ：聚合酶螺旋恒温扩增反应 （ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓｐｉｒａｌｉｓｏｔｈｅｒｍａｌｒｅａｃｔｉｏｎ）
ＤＮＡ：脱氧核糖核酸 （ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）
ｄＮＴＰ：脱氧核糖核苷三磷酸 （ｄｅｏｘｙ～ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）
５ 检测对象
检测对象包括：
---国境口岸出现的不明样本和环境样本；
---啮齿动物及寄生蚤、洞干蚤等样本；
---国境口岸来自鼠疫疫区的有症状或其他不能排除鼠疫耶尔森菌感染的人员样本。
６ 生物安全要求
实验过程中生物安全要求如下：
---检测工作中按GB １９４８９和 ＷＳ２３３中相关要求做好个体防护；
---应遵循《人间传染的病原微生物名录》中的生物安全要求进行，鼠疫菌核酸检测应在生物安全
二级（ＢＳＬ-２）实验室；
---应遵循GB １９４８９对废弃物的处理要求对废弃物品进行处理。
７ 主要仪器与试剂
７．１ 主要仪器
主要仪器设备如下：
荧光ＰＣＲ仪；或核酸扩增仪；或恒温扩增检测仪；或金属浴；或水浴锅：６５℃±１℃；９５℃±１℃。
７．２ 主要试剂
使用的主要试剂如下：
---多功能样品处理液：含５％Ｃｈｅｌｅｘ-１００，１％ ＴｒｉｔｏｎＸ-１００的ＴＥ缓冲液（Ｔｒｉｓ１０ｍＭ，ＥＤＴＡ
１ｍＭ）（具体配制方法参见附录Ａ）；
---鼠疫菌螺旋恒温扩增快速检测试剂盒：包括核酸免提取试剂（多功能样品处理管１，含多功能样
品处理液），鼠疫菌ＰＳＲ一滴法现场检测试剂盒２（具体方法参见附录Ｂ），鼠疫菌实时荧光
ＰＳＲ检测试剂盒３（具体方法参见附录Ｃ）；
注１，２，３：试剂１、２、３由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果
其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。
---引物：以鼠疫菌Ｆ１基因保守序列设计（ＧｅｎＢａｎｋ号：Ｘ６１９９６．１的）引物组，组成如下：
---ｄＮＴＰ：四种核苷酸，每种浓度均为１０ｍＭ；
---反应缓冲液（ＲＭ）：Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ２０．０ｍＭ，硫酸铵１０．０ｍＭ，氯化钾１０．０ｍＭ，硫酸镁８．０ｍＭ，
Ｔｗｅｅｎ-２００．１％，甜菜碱０．８Ｍ，ｄＮＴＰ（每种各）１．４ｍＭ，引物ＦＰ、ＢＰ各１．６μＭ，ＩＦ０．８μＭ，
ｐＨ８．８；
---显色液：甲酚红２．０ｍＭ，苯酚红０．５ｍＭ。或荧光染料：ＥｖｅＧｒｅｅｎ（２０×水溶液）。二者选一；
---阳性对照：可溯源的已鉴定菌株，或含目的片段的ＤＮＡ。
８ 检测程序
８．１ 样本前处理
８．１．１ 白色粉末、物体表面等环境样本
以无菌生理盐水或多功能样品处理液浸湿无菌采样棉签，沾取白色粉末，或擦拭受污物体表面，置
于含２ｍＬ多功能样品处理液的试管内，油性笔编号标记待检。
８．１．２ 啮齿动物脏器样本
以无菌操作采取的肝、脾、肺、心血及有可疑病理改变的淋巴结等组织，加入４滴～８滴（约１００μＬ～
２００μＬ）研磨液（生理盐水或多功能样品处理液）研磨。用采样棉签沾取研磨匀浆液（约５０μＬ～
１００μＬ），置于含２ｍＬ多功能样品处理液的试管内，油性笔编号标记待检。
８．１．３ 蚤样本
蚤经种类鉴定后，以采集时间、地点、种类分组，１０只～２０只为一组待检样本。待检样本加入
４滴～８滴 （约１００μＬ～２００μＬ）研磨液（生理盐水或多功能样品处理液）研磨。用采样棉签沾取研磨匀浆液（约５０μＬ～１００μＬ），置于含２ｍＬ多功能样品处理液的试管内，油性笔编号标记待检。
８．１．４ 人体样本
可包括人静脉血、淋巴液、带血痰液、带血粪便、咽部分泌物、眼分泌物、水泡／脓泡液、脑脊液、溃疡
面和痂皮下的创面等。无菌采集的待检者的静脉血３ｍＬ～５ｍＬ，室温静置数ｍｉｎ使血液凝固，上层为
血清。用采样棉签沾取血清、淋巴液、带血痰液、分泌物或固体排泄物，置于含２ｍＬ多功能样品处理液
的试管内，油性笔编号标记待检。
８．２ 鼠疫耶尔森菌的PSR检测
８．２．１ 样本处理与模板制备
将采样棉签置于含２ｍＬ多功能样品处理液的试管内，摇动混匀后，置于恒温扩增检测仪（或金属
浴、水浴锅），９５℃加热１０ｍｉｎ。取出至室温后即可作为样本ＤＮＡ模板。
８．２．２ PSR反应体系及加样
鼠疫耶尔森菌ＰＳＲ反应的结果判定可选用显色法，也可选择荧光染料法，其反应体系及加样量分
别见表１和表２。设阳性、阴性对照检测。
８．２．３ 扩增
显色法：将反应管置于核酸扩增仪（或恒温扩增检测仪、金属浴、水浴锅、加热模块），６５℃恒温反应
４０ｍｉｎ。
荧光染料法：将反应管置于荧光定量ＰＣＲ仪，程序设置见表３。
８．２．４ 质量控制
８．２．４．１ 显色法有效实验应同时满足如下条件：
---阴性对照颜色仍为粉红色；
---阳性对照颜色变为黄色。
８．２．４．２ 荧光染料法有效实验应同时满足如下条件：
---阳性对照在反应阶段出现Ｓ型扩增曲线，且溶解曲线为单一峰；
---阴性对照在反应阶段无扩增曲线，且溶解曲线无峰出现。
８．２．５ 结果判定
８．２．５．１ 显色法，待反应管冷却至室温后观察结果，根据以下条件进行结果判定：
---阳性结果：待检样本反应管液体呈黄色，表示检出鼠疫耶尔森菌核酸，该样本检测结果为初筛
阳性；
---阴性结果：待检样本反应管液体呈粉红色，表示未检出鼠疫耶......
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