| 标准编号 | SN/T 5146-2019 (SN/T5146-2019) | | 中文名称 | 出口食品中左旋肉碱的测定 高效液相色谱和液相色谱-质谱/质谱法 | | 英文名称 | Determination of L-carnitine in the foods for export HPLC method and HPLC-MS/MS method | | 行业 | 商检行业标准 (推荐) | | 中标分类 | C53 | | 国际标准分类 | | | 字数估计 | 13,156 | | 发布日期 | 2019-10-25 | | 实施日期 | 2020-05-01 | | 标准依据 | 海关总署公告2019年第166号 | | 发布机构 | 海关总署 | SN/T 5146-2019: 出口食品中左旋肉碱的测定 高效液相色谱和液相色谱-质谱/质谱法
SN/T 5146-2019 英文名称: Determination of L-carnitine in the foods for export HPLC method and HPLC-MS/MS method
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
出口食品中左旋肉碱的测定
高效液相色谱和液相色谱-质谱/质谱法
中华人民共和国海关总署发布
1 范围
本标准规定了出口食品中左旋肉碱的高效液相色谱和液相色谱-质谱/质谱测定方法。本标准适用于乳粉、饮料等食品中左旋肉碱的测定。
注：若样品中存在右旋肉碱，液相色谱-质谱/质谱法的测定结果为左旋肉碱和右旋肉碱的总和。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T 6682,neqISO 3696:1987)
第一法 高效液相色谱法
3 方法提要
试样中的左旋肉碱经稀盐酸提取，皂化后便结合态的左旋肉碱游离出来。阳离子交换固相萃取柱净化，在氯甲酸丁酯、三乙胺的催化下与丙酰胺β萘胺发生取代反应，生成紫外吸收较强的化合物，供配有二级管阵列检测器或紫外检测器的高效液相色谱仪测定，外标法定量。
4 试剂和材料
除特殊注明外，所有试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
4.1 乙腈：色谱纯。
4.2 甲醇：色谱纯。
4.3 氨水：分析纯。
4.4 盐酸：优级纯。
4.5 氢氧化钾：分析纯。
4.6 三氯甲烷：分析纯。
4.7 氯甲酸丁酯：分析纯。
4.8 三乙胺：分析纯。
4.9 L-丙酰胺-β-萘胺：分析纯。
4.10 碳酸氢钠：优级纯。
4.11 磷酸二氢钾：优级纯。
4.12 磷酸：优级纯。
4.13 1mol/L盐酸溶液：取90mL盐酸(4.4),加水定容至1000mL。
4.14 0.1 mol/L盐酸溶液：取9mL盐酸(4.4),加水定容至1000mL。
4.15 10 mmol/L盐酸溶液：取10mL0.1 mol/L盐酸溶液(4.14),加水定容至100mL。
4.16 1 mol/L氢氧化钾溶液：取56g氢氧化钾(4,5),加水定容至1000mL。
4.174%氨水甲醇溶液：取4mL氨水(4.3)用甲醇(4.2)定容至100mL。
4.18 混合型阳离子交换固相萃取柱(Mixed-mode cation ion exchange SPE):Oasis MCX”3 mL,60 mg或相当者。使用前依次用3mL甲醇(4.2)、3mL水和3mL10 mmol/L盐酸(4.13)对柱子进行活化。
4.19 衍生试剂：称取0.45gL-丙酰胺-β-萘胺，加乙腈溶解并定容至100mL。
4.20 催化剂I:称取0.50g三乙胺，加三氯甲烷(4.5)混匀定容至100mL。
4.21 催化剂Ⅱ:称取0.50g氯甲酸丁酯，加三氯甲烷(4.5)混匀定容至100mL。
4.22 50 mmol/L碳酸氢钠溶液：称取0.42g碳酸氢钠(4.9),加水溶解并定容至100mL。
4.2350 mmol/L磷酸二氢钾缓冲溶液(pH2.8):称取6.80g磷酸二氢钾，用1000mL水溶解，用磷酸
调节pH值到2.8。
4.24 乙腈溶液(90+10)(v/v):量取90mL乙腈和10mL水，混合均匀。
4.25标准品：左旋肉碱(L-carnitine),CAS号：541-15-1,纯度大于98%。
4.26左旋肉碱标准储备液：准确称取适量的标准物质(4.25),用乙腈溶液(4.24)配置成浓度为1mg/mL的标准储备液。4℃以下避光保存。
4.27左旋肉碱标准工作液：准确移取左旋肉碱标准储备液(4.26)10m于100 mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度。配置成浓度为10.0μg/mL的标准工作溶液。4 ℃以下避光保存。
4.28 0.22μm水系微孔滤膜。
5 仪器和设备
5.1高效液相色谱仪：配有二极管阵列检测器或紫外检测器。
5.2分析天平：感量为0.01g和0.1 mg。
5.3旋涡混合器
5.4高速离心机：不小于15000t/mi。
5.5离心机：不小于4000rmim。
5.6 固相萃取装置。
5.7 氮吹浓缩仪。
5.8 超声波清洗器。
5.9 恒温水浴锅。
5.10 pH计：0.01 pH。
6 试样的制备与保存
6.1 试样制备
取有代表性样品约500g,混合均匀，装入洁净容器内密封并做好标识。
6.2 试样保存
试样于4℃冰箱内保存。制样和样品保存过程中，应防止样品受到污染和待测物损失。
1)”非商业性声明：本标准采用的固相萃取柱为Waters公司产品，此处列出仅为提供参考，并不涉及商业目的，鼓励标准使用者尝试不同厂家的固相萃取柱。
7 样品处理
7.1 提取
7.1.1 乳粉、液体饮料类(左旋肉碱含量小于等于1000 mg/kg样品):称取5g(精确到0.01 g)于50mL容量瓶中，加入20mL0.1 mol/L盐酸溶液(4.14),涡旋振荡1min,超声5 min溶解样品，加入5mL1 mol/L氢氧化钾溶液(4.16)涡旋混匀，60℃水浴皂化30min,冷却至室温，加入5mL1 mol/L
盐酸溶液(4.13),涡旋混匀1min,以0.1 mol/L盐酸溶液(4.14)定容至50 mL。取1mL提取液于15mL试管中，加入9mL乙腈，涡旋混匀1min后取部分于5mL离心管中，16000 r/min离心5 min,所得上清液待净化。
7.1.2 液体饮料类(左旋肉碱含量大于1000 mg/kg样品):先稀释至左旋肉碱含量小于等于1000 mg/kg,然后按照7.1.1的方法提取。
7.1.3 固体饮料类：称取适量样品，用水溶解并稀释至左旋肉碱含量小于等于1000 mg/kg,然后按照
7.1.1的方法提取。
7.2 净化
取1mL待净化溶液于活化好的阳离子固相萃取柱(4.18)中，以1滴/秒的速度过柱，用3mL10 mmol/L的盐酸水溶液(4.15)淋洗，弃去淋洗液，真空抽于1min,用2mL4%氨水甲醇(4.17)溶液洗脱，收集洗脱液于15mL离心管中，40℃下氮气吹干。所得残渣待衍生。
7.3 衍生
在残渣中加入0.5mL衍生试剂(4.19),超声]min溶解残渣并混匀，再依次加入0.5 mL催化剂I
(4.20)和0.5 mL催化剂Ⅱ(4.21),漩涡混匀③min,室温下静置反应30 min后，加入1mL 50 mmol/L
碳酸氢钠水溶液(4.22),漩涡混匀3 min终止反应。4000 r/min离心5min,取上层水相过0.22μm滤
膜(4.28),供液相色谱测定，测定需在2h内完成。
8高效液相色谱测定
8.1 液相色谱参考条件
液相色谱条件如下：
a)色谱柱：Cis柱，100 mm(柱长)×4.6 mm(内径),粒度3.5μm,或相当者；
b) 流动相：50 mmol/L磷酸二氢钾(4.23):乙腈=75:25;
c) 流速：0.8mL/min,12 min;
d)柱温：35℃;
e) 进样量：10pL
f) 检测波长：244 nm
8.2 测定
分别吸取25μL、50μL、100μL、500μL、1000μL左旋肉碱标准工作液(4.27)于离心管中，按7.3的方法衍生。所得左旋肉碱衍生产物标准系列浓度为0.25μg/mL、0.50pg/mL、1pg/mL、5μg/mL、10pg/mL,在上述色谱条件下测定标准工作溶液和样液，外标法定量。左旋肉碱衍生产物参考保留时
间为3.8 min。左旋肉碱衍生产物标准色谱图见附录A中图A.1。
9 空白试验
除不加试样外，均按上述操作步骤进行。
10计算
10.1 试样中左旋肉碱的含量利用数据处理系统或按照式(1)计算(计算结果需将空白值扣除)。
10.2 检出限(LOD)与定量限(LOQ)
本方法的检出限为10mg/kg;定量限为25 mg/kg。
11 回收率
液相色谱法的室内回收实验，以不同样品为空白基质，进行三个浓度水平的添加回收实验，三个浓度包括了定量低限、允许最少添加量和允许最大添加量，每个浓度水平进行10次重复实验，测得左旋肉碱回收率范围见附录B中表B.1。
第二法液相色谱-质谱/质谱法
12方法提要
试样中的左旋肉碱经稀盐酸提取，皂化后使结合态的左旋肉碱游离出来。阳离子交换固相萃取柱净......
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