| 标准编号 | SN/T 5198-2020 (SN/T5198-2020) | | 中文名称 | 熊蜂短膜虫检疫技术规范 | | 英文名称 | (Technical specifications for the quarantine of Bumblebee Brachyhymenium) | | 行业 | 商检行业标准 (推荐) | | 中标分类 | B41 | | 国际标准分类 | 65.020.30 | | 字数估计 | 10,144 | | 发布日期 | 2020-12-30 | | 实施日期 | 2021-07-01 | | 标准依据 | 海关总署公告2020年第136号 | | 发布机构 | 海关总署 | SN/T 5198-2020: 熊蜂短膜虫检疫技术规范
SN/T 5198-2020 英文名称: (Technical specifications for the quarantine of Bumblebee Brachyhymenium)
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T 5198-2019
代替 SN/T 1162-2002
熊蜂短膜虫检疫技术规范
中华人民共和国海关总署 发 布
前言
本文件按照 GB/T 1.1-2020 的规定起草。
本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。
本文件起草单位：中华人民共和国福州海关、中华人民共和国海口海关、中华人民共和国北京
海关、福建农林大学、厦门瑞德利校准检测技术有限公司。
本文件主要起草人：张体银、郑腾、李丹丹、张伟、黄少康、王武军、张志灯、于师宇、白泉
阳、陈美传。
熊蜂短膜虫检疫技术规范
1 范围
本文件规定了熊蜂短膜虫检疫的聚合酶链式反应和实时荧光聚合酶链式反应检测技术。
本文件适用于熊蜂短膜虫的检疫。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用
文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）
适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
4 设备、材料和试剂
4.1 设备
4.1.1 高压灭菌锅。
4.1.2 梯度PCR扩增仪。
4.1.3 荧光PCR仪。
4.1.4 高速冷冻离心机（转速12 000 r/min）。
4.1.5 微量移液器。
4.1.6 生物安全柜。
4.1.7 DNA相对分子质量标准品（100 bp ～1 000 bp）。
4.1.8 水平电泳仪。
4.1.9 凝胶成像系统。
4.1.10 电子天平（感量0.01 g）。
4.1.11 冰箱（2 ℃～8 ℃和–20 ℃）。
4.2 试剂
4.2.1 水：符合GB/T 6682中一级水的规格。
4.2.2 液氮。
4.2.3 无水乙醚。
4.2.4 无水乙醇。
4.2.5 0.01 mol/L磷酸盐（PBS）缓冲液，配制方法见附录A中A.1。
4.2.6 10% SDS溶液，配制方法见附录A中A.2。
4.2.7 蛋白酶K。
4.2.8 5 mol/L的NaCl溶液，配制方法见附录A中A.3。
4.2.9 CTAB/NaCl溶液，配制方法见附录A中A.4。
4.2.10 三氯甲烷/异戊醇混合液，配制方法见附录A中A.5。
4.2.11 酚/三氯甲烷/异戊醇混合液，配制方法见附录A中A.6。
4.2.12 异丙醇。
4.2.13 TE缓冲液。
4.2.14 10×PCR 缓冲液。
4.2.15 dNTPs（含dCTP、dGTP、dATP、dTTP）。
4.2.16 Taq DNA聚合酶。
4.2.17 琼脂糖。
4.2.18 0.5×TBE缓冲液，配制方法见附录A中A.7。
4.2.19 上样缓冲液，配制方法见附录A中A.8。
4.2.20 EB（10 mg/mL），配制方法见附录A中A.9。
4.2.21 DNA相对分子质量标准物Marker。
4.2.22 DNA纯化回收试剂盒。
4.3 PCR引物
根据熊蜂短膜虫 ITS 基因核酸序列设计，扩增长度为 447 bp（参见附录 B 中 B.1），用水溶解至 10
μmol/L 后，保存于-20 ℃备用。
4.4 实时荧光PCR引物和探针
4.5 质控物质
使用感染熊蜂短膜虫的熊蜂腹部组织或含目的片段的 DNA 作为阳性对照，使用未感染熊蜂短膜
虫的健康熊蜂腹部组织作为阴性对照，用水作为空白对照。
5 采样
5.1 采样比例
5.1.1 当蜂群数量小于等于10群时，所有蜂群均采样。
5.1.2 当数量在11～100群时，以10群采样量为基础，每增加10群，采样量增加1群。
5.1.3 当蜂群数量为101～200群时，按总群数的15％采样。
5.1.4 当蜂群数量大于等于201群时，按总群数的10％采样。
5.2 采样方法
从待检蜂群中采取活力较弱的熊蜂 10～20 只，放入烧杯内盖好，记录群号。检疫前先将活蜂用
乙醚处死或置于冰箱冷冻室内冷冻 10 min。
6 PCR检测
6.1 DNA的提取
6.1.1 剪取所采得熊蜂腹部组织样品置于灭菌过的研钵中，加入适量液氮反复研磨成粉末状，也可使
用磷酸盐缓冲液研磨成匀浆，转移至1.5 mL离心管中，12 000 r/min 离心2 min，弃上清液，加入50 μL
TE缓冲液，使样品充分悬浮后，加入60 μL 10% SDS溶液和10 μL 20 mg/mL的蛋白酶K，混匀后于37 ℃
下温育1 h。
6.1.2 加入100 μL 5 mol/L的NaCl溶液，上下颠倒充分混匀，加入80 μL CTAB/NaCl溶液，混匀后65 ℃
温育10 min；加入700 μL三氯甲烷/异戊醇混合液（体积比为24: 1），混匀后12 000 r/min离心5 min。
6.1.3 吸取上清液至另一干净离心管，加入等体积的酚/三氯甲烷/异戊醇混合液（三者体积比为
25: 24: 1），上下颠倒混匀，12 000 r/min 离心5 min。
6.1.4 吸取上清液至另一干净离心管，加入 2 倍体积预冷的异丙醇沉淀 DNA，轻轻混匀，4 ℃下
12 000 r/min离心15 min，彻底去除上清液。
6.1.5 用600 μL 70%预冷乙醇洗涤沉淀，4 ℃下12 000 r/min离心10 min，弃上清液，再瞬时离心，用移
液器彻底吸除酒精，在超净工作台上自然晾干。
6.1.6 加入20 μL TE溶液溶解DNA，-20 ℃下保存。DNA提取也可选用等效的商品化试剂盒。
6.2 PCR扩增
6.2.1 反应体系
普通 PCR 反应体系见表 1。PCR 扩增可以采用等效的商品化 DNA 扩增试剂盒。
6.2.2 反应程序
94 ℃预变性 5 min；之后 94 ℃变性 45 s，59 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 45 s，共 35 个循环；72 ℃补
充延伸 10 min，4 ℃保温。同时设阳性对照、阴性对照和空白对照。
6.3 琼脂糖凝胶电泳
用 TBE 电泳缓冲液配制 1.5% 的琼脂糖凝胶。将凝胶放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶
面。将 6 μL 样品和 2 μL 上样缓冲液按比例混匀后加入样品孔。在电泳时使用 DNA 相对分子质量标准
品作对照。5 V/cm 电泳约 0.5 h，当指示剂到达底部时停止。
6.4 凝胶成像分析和测序
将电泳完毕的凝胶放入含 0.5 μg/mL EB 溶液中染色 10 min ～30 min 后（或等效商品化核酸染料配
置琼脂糖凝胶时直接溶解在凝胶中），在水中漂洗凝胶，用凝胶成像仪观察并判断结果，经核酸扩增
电泳后如出现一条大小约 447 bp 的 DNA 片段，应切胶回收 DNA 片段进行测序，参考序列参见附录 B
中 B.1。
6.5 结果判定
经核酸扩增电泳后阳性对照会出现一条大小约 447 bp 的 DNA 片段，而阴性对照和空白对照无条
带时，试验成立。待检样品经核酸扩增电泳后，在阳性对照相应位置上有条带并经测序验证者为阳
性。无条带或条带的大小不是约 447 bp 的为阴性。
7 实时荧光PCR检测
7.1 DNA提取
同 6.1。
7.2 实时荧光PCR扩增
7.2.1 反应体系
实时荧光 PCR 反应体系见表 2。实时荧光 PCR 扩增可以采用等效的商品化荧光定量 PCR 试剂盒。
7.2.2 反应程序
95 ℃预变性 5 min；之后 95 ℃变性 15 s，60 ℃退火 30 s，收集荧光，共 40 个循环。同时设阳性对
照、阴性对照和空白对照。
7.3 结果判断
7.3.1 综合分析仪器给出的各项结果，基线以仪器给出的默认值作为参考，阈值设定原则以阈值线刚
好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点为准，具体根据仪器噪音情况进行调整，选择 FAM 通道进行
分析。
7.3.......
|