SN/T 5227.4-2019 相关标准英文版PDF
| 标准号码 | 价格美元 | 第2步(购买) | 交付天数 | 标准名称 |
| SN/T 5227.4-2019 | 209 | SN/T 5227.4-2019 | [PDF]天数 <=3 | 出口食品中鸭源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA法) |
| 基本信息 | |
|---|---|
| 标准编号 | SN/T 5227.4-2019 (SN/T5227.4-2019) |
| 中文名称 | 出口食品中鸭源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法(RAA法) |
| 英文名称 | (Rapid detection of duck-derived components in exported foods Recombinase-mediated strand replacement nucleic acid amplification method (RAA method)) |
| 行业 | 商检行业标准 (推荐) |
| 中标分类 | C53 |
| 国际标准分类 | 67.050 |
| 字数估计 | 9,918 |
| 发布日期 | 2019 |
| 实施日期 | 2020-07-01 |
| 发布机构 | 海关总署 |
SN/T 5227.4-2019
Rapid detection of duck derived ingredient in food for export
Real-time recombinase-aid amplification （RAA） method
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
2019-12-27 发布
2020-07-01 实施
中华人民共和国海关总署 发 布
前言
SN/T 5227-2019《出口食品中动物源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA
法）》分为 11 个部分：
第 1 部分：出口食品中鸡源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；
第 2 部分：出口食品中猪源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；
第 3 部分：出口食品中羊源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；
第 4 部分：出口食品中鸭源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；
第 5 部分：出口食品中牛源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；
第 6 部分：出口食品中水牛源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；
第 7 部分：出口食品中马源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；
第 8 部分：出口食品中驴源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；
第 9 部分：出口食品中狐狸源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；
第 10 部分：出口食品中貂源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；
第 11 部分：出口食品中大鼠源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）。
本部分为 SN/T 5227-2019 的第 4 部分。
本部分按照 GB/T 1.1-2009 的规则进行编写。
本部分由中华人民共和国海关总署提出并归口。
本部分起草单位：中华人民共和国郑州海关、中华人民共和国北京海关、中国检验检疫科学研
究院、中国动物卫生与流行病学中心、中华人民共和国厦门海关、中华人民共和国拱北海关、中华人
民共和国大连海关、中华人民共和国杭州海关、中华人民共和国福州海关。
本部分主要起草人：苗丽、汪琳、乔晴、邓婷婷、李阳、张九凯、徐淑菲、罗宝正、郑秋月、
吴姗、孔繁德、郑晶。
出口食品中鸭源性成分快速检测
重组酶介导链置换核酸扩增法（RAA 法）
1 范围
本部分规定了出口食品中鸭源性成分的 RAA 检测方法。
本部分适用于出口食品中鸭源性成分的定性检测。此标准所规定方法的最低检出限（LOD）为
0.01%（W/W）。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本
文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 27403-2008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测
3 术语、定义和缩略语
3.1 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1.1 鸭 Anatinae
雁形目，鸭科，鸭亚科，鸭族，鸭属，常说的鸭是鸭亚科水禽的统称，也称真鸭。分为潜水鸭，
钻水鸭和栖鸭。
3.1.2 实时荧光 RAA real-time RAA
一种重组酶介导链替换的恒温核酸快速扩增技术（简称 RAA 技术）。利用从细菌或真菌中获得的
重组酶，在恒温下（一般为 37~42 ℃），该重组酶可与引物紧密结合，形成酶和引物的聚合体，在单
链 DNA 结合蛋白的帮助下，打开模板 DNA 的双链结构，当引物在模板 DNA 上搜索到与之完全匹配
的互补序列时，在 DNA 聚合酶的作用下，形成新的 DNA 互补链，扩增产物以指数级增长。利用荧光
探针的标记，随着 RAA 反应的进行，RAA 产物与荧光信号的增长呈现对应关系。
3.1.3 Ct 值 cycle threshold
每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。
3.1.4 T 值 Time threshold
每个反应管内荧光信号达到设定阈值时所需要的时间。
3.2 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
3.2.1 RAA ：recombinase-aid amplification，重组酶介导扩增。
3.2.2 DNA ：deoxyribonuleic acid，脱氧核糖核酸。
3.2.4 Tris ：tris（Hydroxymethyl）aminomethane，三羟甲基氨基甲烷。
3.2.5 EDTA ：ethylene diaminetetraacetic acid，乙二胺四乙酸。
3.2.6 dNTPs ：deoxyribonuleoside triphosphate，脱氧核苷三磷酸。
3.2.7 SSB ：single stranded DNA binding protein，单链 DNA 结合蛋白。
3.2.8 SC-recA ：Streptomyces coelicolor recombinase，天蓝色链霉菌重组酶。
3.2.9 BS-recA ：Bacillus subtilis recombinase，枯草芽孢杆菌重组酶。
3.2.10 Bsu ：Bacillus subtilis，枯草芽孢杆菌。
3.2.11 Tricine ：N-tris [Hydroxymethyl] methylglycine，N- 三羟甲基甲基氨基酸。
4 方法提要
以提取的 DNA 为模板，采用鸭的特异性检测引物和探针进行实时荧光 RAA 扩增，根据实时荧光
RAA 的增幅情况，实现对食品和饲料中鸭成分的检测鉴定。
5 试剂和材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合 GB/T 6682 的要求。所有试剂均
用无 DNA 酶污染的容器分装。
注：目的基因序列见附录 A。F 为上游引物，R 为下游引物，P 为探针，FAM-dT，THF，BQH-dT 和 C3spacer
均为探针修饰基团。
5.1 CTAB 提取缓冲液（pH8.0）：10 g/L CTAB，0.7 mol/L NaCl，0.05 mol/L Tris-HCl，0.01 mol/L
Na2EDTA。
5.2 酚 ： 氯仿 ： 异戊醇 =25 ： 24 ： 1。
5.3 异丙醇。
5.4 70% 乙醇（V/V）。
5.5 TE 缓冲液（pH8.0）：10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1mmol/L EDTA（pH8.0）。
5.6 A Buffer（缓冲液 A）：20% 聚乙二醇。
5.7 实时荧光 RAA 扩增体系：2.5 mmol/L dNTPs，225 ng/μL SSB，300 ng/μL recA 重组酶蛋白（SC-
recA/BS-recA），75 ng/μL Bsu DNA 聚合酶，75 ng/μL Exo 核酸外切酶，250 mmol/L Tricine，12.5 mmol/
L 二硫苏糖醇，250 ng/μL 肌酸激酶。也可以使用等效的商品化的试剂盒代替。
5.8 B Buffer（缓冲液 B）：280 mM 醋酸镁。
6 仪器设备
6.1 实时荧光 PCR 仪。
6.2 恒温荧光检测仪。
6.3 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。
6.4 恒温水浴锅。
6.5 离心机：转速≥ 12 000 r/min。
6.6 微量移液器：量程 0.5 μL~10 μL，10 μL~100 μL，20 μL~200 μL，200 μL~1 000 μL。
6.7 研钵及粉碎装置。
6.8 涡旋震荡器。
6.9 离心管：2 mL、1.5 mL。
7 检测步骤
7.1 DNA 提取
取 0.2g 粉碎或磨碎的样品至一洁净的 1.5 mL 离心管中（若样品含杂质和调味品，可加入 1 mLdd
H2O 洗涤两次），加入 600 μL CTAB 提取缓冲液，涡旋震荡混匀后于 70 ℃温育 15 min，期间颠倒离
心管 2 次 ~3 次； 12 000 r/min 离心 5 min，取上清于一新的干净 1.5 mL 离心管中；加入 500 μL 酚 ： 氯
仿 ： 异戊醇（25 ： 24 ： 1），上下颠倒离心管 2 次 ~3 次后涡旋震荡混匀，12 000 r/min 离心 5 min ；转
移上层水相至一新的 1.5 mL 离心管中，加入 0.7 倍体积异丙醇，上下颠倒离心管 2 次 ~3 次，4 ℃静
置 30 min，4 ℃下 12 000 r/min 离心 3 min，小心弃去上清液；加入 700 μL 70 % 乙醇，重悬沉淀，12
000 r/min 离心 1 min，小心弃去上清液；打开管盖，室温挥发干液体，加入 50 μL ~100 μL TE（pH8.0）
缓冲液溶解 DNA，-20 ℃保存备用。
DNA 提取也可采用等效 DNA 提取试剂盒进行。
7.2 DNA 浓度和纯度的测定
使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测 260 nm 和 280 nm 处的吸光值 A260 和 A280。DNA
的浓度按照公式（1）计算：
当 A260/A280 比值在 1.7~1.9 之间时，适宜于 RAA 扩增。
7.3 实时荧光 RAA 扩增
7.3.1 实时荧光 RAA 反应总体系
7.3.2 实时荧光 RAA 反应程序
可选用以下两种扩增仪器之一进行检测，反应程序对应如下。
7.3.3 实时荧光 PCR 仪
39 ℃，60 s，1 个循环；39 ℃，30 s，40 个循环，在每次循环时收集荧光。
7.3.4 恒温荧光检测仪
39 ℃，1 min ；39 ℃，20 min，第二阶段开始收集荧光。
7.3.5 实验对照
检测过程中分别设阳性对照、阴性对照、空白对照。采用含有鸭源成分的样品作为阳性对照样
品，不含鸭源成分的样品作为阴性对照，以与模板等体积的双蒸水作为空白对照。
8 质量控制
8.1 实时荧光 PCR 仪
8.1.1 空白对照：无荧光对数增长，相应的无报告 Ct 值。
8.1.2 阴性对照：无荧光对数增长，相应的无报告 Ct 值。
8.1.3 阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的 Ct 值≤ 30.0。
8.2 恒温荧光检测仪
8.2.1 空白对照：无荧光对数增长，相应的无报告 T 值（时间）。
8.2.2 阴性对照：无荧光对数增长，相应的无报告 T 值（时间）。
8.2.3 阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的 T 值（时间）≤ 15min。
9 结果判断与表述
9.1 结果判定
9.1.1 实时荧光 PCR 仪
9.1.1.1 在符合条款 8.1 的情况下，结果才能判为有效。
9.1.1.2 如 Ct 值≤ 35.0，则判定被检样品阳性。
9.1.1.3 如 35.0 ＜ Ct 值＜ 40.0，则重复一次。如再次检测结果仍然是 35.0 ＜ Ct 值＜ 40.0，则判定
为被检样品阳性。
9.1.1.4 如无报告 Ct 值或无荧光对数增长则判定被检样品阴性。
9.1.2 恒温荧......