| 标准编号 | SN/T 5275-2019 (SN/T5275-2019) | | 中文名称 | 象牙及其制品鉴定技术规范 | | 英文名称 | (Technical specification for identification of ivory and its products) | | 行业 | 商检行业标准 (推荐) | | 中标分类 | B41 | | 国际标准分类 | 11.220 | | 字数估计 | 14,115 | | 发布日期 | 2019 | | 实施日期 | 2020-07-01 | | 发布机构 | 海关总署 | SN/T 5275-2019: 象牙及其制品鉴定技术规范
SN/T 5275-2019 英文名称: (Technical specification for identification of ivory and its products)
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
象牙及其制品鉴定技术规范
中华人民共和国海关总署 发 布
前言
本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布
机构不承担识别这些专利的责任。
本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。
本标准主要起草单位：中华人民共和国南宁海关、中华人民共和国北京海关、中华人民共和国
拱北海关。
本标准主要起草人：陈立军、罗兆飞、韦莹、盘宝进、杜智欣、金煜、张利峰、刘军义、莫丽、
刘艳华、孔祥军、韦献克、覃勉、罗宝正、陈应超、刘闯、白素英、洪体玉。
象牙及其制品鉴定技术规范
1 范围
本标准规定了象牙及其制品形态学和分子生物学鉴定方法。
本标准适用于象牙及其制品的鉴定。
2 规范性引用文件
下列文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本
标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
5 试剂和材料
以下所用的试剂除特别注明者外均为分析纯，所用的水为双蒸水或去离子水，应符合 GB/T 6682
所规定一级水的要求。所有涉及分子生物学操作的水均为无 DNA 酶、无 RNA 酶水。
5.1 DNA 抽提试剂盒。
5.2 PCR 扩增试剂。
5.3 TBE 电泳缓冲液。
5.4 琼脂糖（电泳级）。
5.5 乙二胺四乙酸二钠（EDTA）。
5.6 DNA 分子量标准品（100 bp-2000 bp）。
5.7 EB 或 EB 替代核酸染液。
5.8 蛋白酶 K。
5.9 次氯酸钠。
5.10 无水乙醇。
5.11 三氯甲烷。
5.12 PCR 反应管：200 μL。
5.13 Eppendorf 离心管：1.5 mL。
5.14 带滤芯吸头（10 μL、20 μL、200 μL、1000 μL）。
6 仪器和工具
6.1 PCR 仪。
6.2 电泳仪。
6.3 凝胶成像系统。
6.4 遗传分析仪。
6.5 水浴锅。
6.6 台式高速冷冻离心机。
6.7 体视显微镜。
6.8 电子天平：精度 1 mg。
6.9 涡旋振荡器。
6.10 各类型微量移液器。
6.11 冰箱。
6.12 放大镜（各类型）。
6.13 波长 365 nm 的紫外光灯。
6.14 切割工具（电钻、电锯、钢锯、手术刀等）。
6.15 酒精灯。
6.16 钢针。
6.17 LED 手电。
6.18 防护用具（防护眼镜、防护面罩等）。
6.19 Image J 软件或其他具有角度测量功能的软件。
7 鉴定一般原则
7.1 象牙及其制品典型形态特征完整、明确的，直接采用形态学方法进行鉴定。
7.2 形态学方法无法认定，结合分子生物学方法进行综合鉴定。
8 鉴定方法
8.1 形态学鉴定方法
8.1.1 肉眼观察
8.1.1.1 观察颜色、外形等项目。
8.1.1.2 观察横截面、纵剖面及一些纹理特征（施氏结构）。
8.1.2 显微观察
8.1.2.1 将样本的横截面清洗干净，置于放大镜或者体视显微镜下。
8.1.2.2 用反射光观察样品的横截面和纵剖面结构特征。
8.1.3 焙烤及热针试验
8.1.3.1 取待检样本，酒精灯火焰上焙烤，闻其气味。
8.1.3.2 取钢针，放在酒精灯火焰上灼烧，待针尖烧红后迅速刺入待检样品，然后趁热取出，观察
样品上热针接触点的变化，并闻其气味。
8.1.4 荧光检查
8.1.4.1 清除样本上附着的可能影响检查结果的异物。
8.1.4.2 在暗室条件下，将样本置于波长 365 nm 的紫外光下，观察样本荧光反应。
8.1.5 外缘施氏角测定
8.1.5.1 将样本手工或机械打磨光滑，使其横截面的施氏结构充分显现。
8.1.5.2 用成像设备记录样本横截面图像。
8.1.5.3 将样本横截面最外缘的环形区域 (宽度约为其半径的 1/10) 设定为鉴定区域。此区域内的所
有施氏角均视为外缘施氏角。
8.1.5.4 利用作图软件将横截面图像进行 20 等分，并将鉴定区域内与等分线重合的施氏线交点标记出来。
8.1.5.5 在每条平分线上随机选取 2 个点，分别用来确定凸面施氏角和凹面施氏角，以保证所选不同
类型施氏角在鉴定区域内呈均匀分布。若等分线未与任何交点重合，则选取与等分线距离最近的 2 个
交点加以标记。每个样本经标记的多个交点所确定的施氏角即为鉴定对象的外缘施氏角。
8.1.5.6 过标记点沿两条施氏线的延展方向向内或向外分别引出射线 (该射线应最大限度地与弧形施
氏线重合)，构成待测外缘施氏角的两条边，利用 Image J 软件（http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html）
或其他具有同等功能软件的角度测量功能测得每个外缘施氏角的度量值。
8.1.6 判定指标
8.1.6.1 外形
整支现生象牙呈月牙或镰刀形弯曲，一端较粗（俗称根部），另一端尖细（俗称牙尖）。猛犸象牙
弯曲度大，多呈扭曲状，由于长埋地下，表层或全部呈现化石状，表层出现颜色改变及矿物质沉积，
甚至形成不规则的斑渍。
8.1.6.2 颜色
一般呈牙白本色（白色、奶白色、瓷白色、淡玫瑰白色），因环境影响，可能呈淡黄色、姜黄色、
深黄色、浅棕色、深褐色等。部分象牙表面有油脂光泽或蜡状光泽。
8.1.6.3 气味
象牙及其制品经焙烤一般产生骨焦味。
8.1.6.4 热针试验
象牙及其制品热针用力无法扎进，仅留针尖扎痕，不会出现凹陷针眼、无白烟和浓烈气味。
8.1.6.5 荧光
在波长 365 nm 的紫外光下，象牙及其制品呈现蓝白或蓝紫色荧光，猛犸象牙有时会伴有紫色瑕点。
8.1.6.6 横截面
象牙及其制品的横截面上可见独有的施氏结构，横截面中部（有时也会偏向一侧）可见牙心，有
的横截面可能存在类似树木年轮样的环纹结构；相较于现生象牙，猛犸牙一般有很厚的牙皮（牙骨质
层），参考附录 A.1。
8.1.6.7 纵剖面
象牙及其制品的纵剖面可见较规则排列的、断续的近直线型纹理，或起伏的波纹、山峰状纹理。
8.1.6.8 外缘施氏角
现生象牙外缘施氏角一般为钝角（平均值大于 115°），猛犸象牙外缘施氏角一般为锐角（平均值
小于 90°），外缘施氏角具有物种识别意义，但在 90°~115° 区间现生象牙和猛犸象牙的外缘施氏角存
在重叠区。现生象牙和猛犸象牙外缘施氏角参考附录 A.2。
8.2 分子生物学检测方法
8.2.1 样品处理和 DNA 提取
8.2.1.1 样品前处理
用 10 % 的次氯酸钠或去离子水擦洗样本表面，无水乙醇冲洗后室温干燥，最后紫外灯照射样本
表面 30 min。
8.2.1.2 样品制备
用机械设备（电钻或电锯）或手工方法于象牙根部（象牙连接头盖骨的一端）最外层牙骨质部位
获取样品碎屑约 200 mg ～ 500 mg。如果该部位不存在或无法确定，则需从样品底部多点取样。质量
较小的样品可根据实际情况酌量取样。
8.2.1.3 样品脱钙
取样品碎屑约 200 mg 于离心管中，同一样品应取 2 管，每管加入 1 mL 0.5 mol/L EDTA 溶液（pH 8.0），
37℃孵育过夜（亦可室温 48 h 孵育，钙化严重的样品可延长至 72 h），12 000 g 离心 2 min，保留 1/4~1/3
的脱钙液与沉淀一并用于 DNA 提取。
8.2.1.4 提取 DNA
CTAB 法（试剂配置参考附录 B）提取样品 DNA，设提取对照。8.2.1.3 中脱钙后的样品，加入 1 mL
CTAB 提取缓冲液、20 μL 蛋白酶 K 和 10 μL RNA 酶 A，65℃温浴裂解 2h~3 h（样品难以裂解时可以适
当延长裂解时间甚至过夜），温浴裂解时可时常将样品取出震荡加速裂解。12 000 g 离心 15 min，上清
转移至一新的离心管。加入等体积的氯仿，充分混匀，12 000 g 离心15 min，上清转移至一新的离心管。
加入 0.6 体积的异丙醇、0.1 体积乙酸钾溶液，轻柔颠倒混合，室温放置 20min。12 000 g 离心 15 min，
弃上清，加入 500 μL 70% 乙醇溶液，颠倒混合数次。12 000 g 离心 10 min，弃上清，加入 50-100 μL
TE 缓冲液溶解 DNA。提取的 DNA 可直接用于 PCR 扩增或-20℃保存备用，长期需 -70℃保存。
也可采用等效 DNA 抽提试剂盒提取样品 DNA，按试剂盒说明书操作。
8.2.2 巢氏 PCR 检测方法
8.2.2.1 巢氏 PCR 扩增引物
扩增引物见表 1。
8.2.2.2 PCR 反应体系
PCR 反应体系（25 μL）见表 2、表 3。其中将第一轮 PCR 扩增的产物用灭菌去离子水进行 10 倍
稀释，以稀释后的扩增产物作为 DNA 模板，进行巢式第二轮扩增。
8.2.2.3 PCR 反应程序
在 PCR 仪上执行如下反应程序：95℃预变性 10 min ；95℃变性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸
60 s，35 个循环；72℃延伸 7 min，4℃保存。
8.2.2.4 PCR 扩增产物凝胶电泳
称取 1.5 g 琼脂糖，加入 100 mL TBE 电泳缓冲液，制备 1.5% 琼脂糖凝胶（55℃ ~60℃左右加入
EB 或者替代核酸染液至终浓度为 0.5 μg/mL）。将 5 μL PCR 扩增产物和 1 μL 加样缓冲液混合，进行点
样。加入 DNA 分子量标记以判断 PCR 扩增产物大小。电压大小一般控制在 3 V/cm~5 V/cm，电泳时
间约 30 min，凝胶成像仪观察并分析保存记录。
8.2.2.5 PCR 扩增产物序列分析
扩增的特异性目的片段进行序列测定，测序结果与核苷酸序列数据库（如 GenBank: https://www.
ncbi.nlm.nih.gov）中的序列进行比对（参考序列见附录 C）。
8.2.2.6 结果判定
8.2.2.6.1 质控标准：阳性对照出现 472 bp 或 450 bp 特异性目的条带，且阴性对照和空白对照无目
的条带。
8.2.2.6.2 经两轮 PCR 扩增，产物电泳后均未出现目的条带，则判为阴性。
8.2.2.6.3 如果经第一轮 PCR 扩增，电泳凝胶出现一条 472 bp 的特异性目的条带，且该条带序列与
数据库对应的现生象或猛犸象序列同源性大于 98.5%，判为阳性。
8.2.2.6.4 如果经第一轮 PC......
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