| 标准编号 | WS/T 590-2018 (WS/T590-2018) | | 中文名称 | 基孔肯雅热诊断 | | 英文名称 | Diagnosis for chikungunya fever | | 行业 | 卫生行业标准 (推荐) | | 中标分类 | C59 | | 字数估计 | 20,249 | | 发布日期 | 2018-03-06 | | 实施日期 | 2018-08-01 | | 标准依据 | 国卫通(2018)4号 | | 发布机构 | 卫生健康委员会 | WS/T 590-2018
Diagnosis for chikungunya fever
ICS 11.020
C 59
WS
中 华 人 民 共 和 国 卫 生 行 业 标 准
基孔肯雅热诊断
2018-03-06发布
2018-08-01实施
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会发布
目次
前言...II
1 范围...1
2 缩略语...1
3 诊断依据...1
4 诊断原则...2
5 诊断...2
6 鉴别诊断...2
附录 A（规范性附录） 基孔肯雅热血清学检测方法...3
附录 B（规范性附录） 基孔肯雅热病原学检测方法...8
附录 C（资料性附录） 基孔肯雅热的鉴别诊断...11
附录 D（资料性附录） 基孔肯雅热流行病学及临床表现...14
参考文献...16
II
前言
本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。
本标准起草单位：广东省疾病预防控制中心、广州市第八人民医院、中国疾病预防控制中心、中国
疾病预防控制中心病毒病预防控制所、东莞市人民医院。
本标准主要起草人：何剑峰、张复春、李德新、王世文、王建、柯昌文、钟豪杰、殷文武、殷思纯、
郭汝宁。
基孔肯雅热诊断
1 范围
本标准规定了基孔肯雅热的诊断依据、诊断原则、诊断及鉴别诊断。
本标准适用于全国各级各类医疗卫生机构及其医务人员对基孔肯雅热的诊断。
2 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
CHIKV：基孔肯雅病毒（chikungunya virus）
ELISA：酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay）
IgG：免疫球蛋白G(immunoglobulin G)
IgM：免疫球蛋白M(immunoglobulin M)
RNA：核糖核酸(ribonucleic acid)
RT-PCR：逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction)
3 诊断依据
3.1 流行病学史
发病前 12 d内，曾经到过基孔肯雅热流行区或居住场所或工作场所周围曾有本病发生。
3.2 临床表现
3.2.1 发热：急起高热，体温可达 39℃以上，一般发热 1 d～7 d。部分病人热退后再次出现发热，表
现为双峰热，持续 3 d～5 d恢复正常。常伴有寒战、头痛、背痛、全身肌肉疼痛，畏光，恶心、呕吐
等症状。
3.2.2 关节疼痛：关节疼痛主要累及手腕和踝趾等小关节，也可涉及膝和肩等大关节，腕关节受压引
起剧烈疼痛是本病的重要特征。急性期多个关节出现疼痛或关节炎表现，可有肿胀或僵硬，晨间较重，
严重者不能活动，通常 1周～3周缓解。部分病例关节疼痛可持续数月。
3.2.3 皮疹：发病后 2 d～5 d，半数以上病例在躯干、四肢伸侧、手掌和足底出现红色斑丘疹或紫癜，
疹间皮肤多为正常，部分伴有瘙痒感，数天后消退，可伴脱屑。
3.3 实验室检查
3.3.1 急性期血清特异性 IgM抗体阳性（见附录 A中 A.1）。
3.3.2 恢复期血清特异性抗体（IgG或中和抗体）滴度比急性期升高 4倍及以上，或急性期抗体阴性
而恢复期抗体阳性（见附录 A中 A.2、A.3）。
3.3.3 急性期血清标本分离到基孔肯雅病毒（见附录 B中 B.1）。
3.3.4 急性期血清标本检测到基孔肯雅病毒核酸（见附录 B中 B.2）。
4 诊断原则
依据患者的流行病学史、临床表现及实验室检查结果进行综合判断。在从未发生过基孔肯雅热流行
的地区，应以实验室检查依据为主。
5 诊断
5.1 疑似病例
符合3.1，3.2.1、3.2.2和/或 3.2.3，并排除登革热和/或其他发热伴出疹性疾病者。
5.2 临床诊断病例
符合5.1，并同时符合3.3.1。
5.3 确诊病例
符合5.1或5.2，并同时符合3.3.2、3.3.3、3.3.4中任一项。
6 鉴别诊断
基孔肯雅热应与登革热、甲病毒（Alphavirus）感染、传染性红斑、感染后关节炎（包括风湿热）、
猩红热、立克次体病（斑疹伤寒、恙虫病）、麻疹、药疹等相鉴别。参见附录C与附录D。
A A
附 录 A
（规范性附录）
基孔肯雅热血清学检测方法
A.1 酶联免疫法检测基孔肯雅病毒（chikungunya virus，以下简称CHIKV）IgM抗体(IgM抗体捕获酶联
免疫吸附试验)
A.1.1 原理
首先用抗人IgM µ链抗体（捕获抗体）包被96孔板，如果待检血清中存在CHIKV抗IgM抗体，则与包
被的捕获抗体结合，然后再与CHIKV抗原结合，最后与加入酶标抗CHIKV抗体结合，酶与显色底物相互作
用就会出现显色反应。
A.1.2 材料和试剂
材料和试剂如下：
a) 包被液：碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液，pH 9.6，1.59 g Na2CO3和 2.93 g NaHCO3溶解于 1 L水中；
b) 洗液：磷酸盐缓冲液（PBS），含 0.05％吐温 20，pH 7.2；
c) 封闭液：含 5％奶粉和 0.05％吐温 20的 PBS；
d) 包被抗体：抗人 IgMμ链抗体；
e) 病毒抗原：灭活的纯化 CHIKV抗原，无感染性；
f) 细胞抗原：经纯化的未感染病毒细胞培养液；
g) 酶标抗体：辣根过氧化物酶标记的 CHIKV单克隆抗体；
h) 酶底物：TMB；
i) 终止液：2N H2SO4；
j) 临床标本：急性期病人血清和/或脑脊髓液标本；阳性和阴性血清对照；
k) 设备：平底 96 孔板，洗板机，酶标仪，恒温箱，单通道和多通道移液器，试剂储液槽，保鲜
袋，吸水纸。
A.1.3 检测方法
按以下步骤操作：
a) 用记号笔在酶标板上标记实验编号，明确每份临床标本的位置。
b) 用 pH 9.6的包被液按 1∶2 000比例稀释抗人 IgMμ链抗体，按 75 µL/孔加入到 96孔板的孔
中，4℃孵育过夜。
c) 倒掉抗体包被液，把板中剩余液体在吸水纸上吸干。每孔加入封闭液 200 µL 封闭反应板。室
温孵育 30 min。
d) 用洗液在自动洗板机上洗板 5次。每次洗涤要保证每孔加满洗液。
e) 病人血清用稀释液进行 1∶100稀释，脑脊髓液进行 1:10稀释，然后按 50 µL/孔，各加 2孔，
同时用稀释液按1∶100比例稀释阳性对照血清和阴性对照血清，各加 2孔。37℃湿盒孵育 1 h。
洗涤 5遍。
f) 稀释病毒抗原和细胞抗原。每排左边 1 孔按 50 µL/孔加入病毒抗原，每排右边 1 孔按 50 µL/
孔加入细胞抗原。4℃湿盒孵育过夜。洗涤 5遍。
g) 按 50 µL/孔加入辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体，37℃湿盒孵育 1 h，洗板 5遍。
h) 所有孔中加 50 µL/孔的 TMB 底物液，包括 1 孔未加样的空白对照孔。避光室温孵育 10 min。
抗体阳性的孔中会逐渐显示出蓝色。
i) 所有孔中加 50 µL/孔的终止液，显示蓝色的孔此时会变成黄色。把酶标板放入酶标仪中，在
450 nm波长处读取 OD值。
A.1.4 结果判断
结果判断规则如下：
a) 如果阳性对照血清病毒抗原孔的光密度（OD）值与细胞抗原孔的 OD值之比≥2.1，检测结果有
效；
b) 如果待检标本病毒抗原孔的 OD值与细胞抗原孔的 OD值之比≥2.1，则可判定待检标本中 CHIKV
IgM抗体阳性。
A.1.5 意义
病人血清或脑脊髓液标本中CHIKV IgM抗体阳性，表示病人新近感染CHIKV，可作为病例诊断的依据。
A.2 间接免疫荧光法（IFA）检测基孔肯雅病毒IgG抗体
A.2.1 原理
IFA就是先用待检血清中的特异抗体（第一抗体）与固定在玻片上的CHIKV抗原反应，如果血清中存
在CHIKV特异性IgM和IgG抗体，就会与荧光标记的抗人IgM和IgG抗体（第二抗体）结合，荧光显微镜下
可见有特异荧光。
A.2.2 材料和试剂
材料和试剂如下：
a) 设备：10 µL、100 µL、200 µL 和 1 000 µL 移液器各一支；荧光显微镜；CHIKV抗原片（可用
BHK-21、Vero或 C6/36等感染细胞制备，低温、干燥、密封保存）；盖玻片；
b) 试剂：CHIKV抗体阳性对照血清、阴性对照血清；荧光素标记抗人 IgG和 IgM荧光抗体；待检
患者血清标本；样品稀释液；磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2）；吐温 20。
A.2.3 检测方法
按以下步骤操作：
a) 取出抗原片，平衡至室温；
b) 如果检测 IgG 抗体，先用标本稀释液稀释待检血清，从 1∶10 开始，倍比稀释至所需要的滴度；
c) 用移液器取适量稀释标本加到每个反应区域（标本量以覆盖所有反应区为准），避免溢出和产
生气泡；
d) 将加有标本的抗原片放置在湿盒内，37℃温箱孵育 30 min；
e) 用含 2‰ 吐温 20的 PBS冲洗抗原片，然后再漂洗 5 min；
f) 取出抗原片，用吸水纸从抗原片背面和侧面擦去洗液（不得擦拭反应区域），加入适量的荧光
素标记抗人 IgM或 IgG荧光抗体,分别用于检测 IgM或 IgG抗体（荧光抗体在使用前须根据说
明书用 PBS稀释）；
g) 将抗原片放置在避光的湿盒内，37℃温箱孵育 30 min；
h) 用含 2‰ 吐温 20的 PBS冲洗抗原片，再将抗原片放入含有 1∶8 000伊文思蓝的吐温 20的 PBS
中漂洗 5 min；
i) 取出抗原片，用吸水纸从抗原片背面和侧面擦去洗液（不得擦拭反应区域），用甘油缓冲液封
片，盖上盖玻片，避免产生气泡；
j) 荧光显微镜下观察结果。
A.2.4 结果判断
结果判断规则如下：
a) 特异性荧光颗粒在镜下呈现黄绿色，如果抗原片的细胞胞浆中呈现出均匀的颗粒状荧光，可判
断 CHIKV特异抗体阳性。
b) 根据荧光光亮度和阳性细胞在细胞总数中所占的比例可将荧光反应大致区分为“+ ～ ++++”，
无特异荧光者为阴性。检测抗体滴度时，抗体滴度为特异荧光达“++”时最高血清稀释度的倒
数。
c) 如果阳性对照显示非特异性荧光或阴性对照显示清晰的荧光，试验则不成立，需重复检测。
A.2.5 意义
恢复期血清IgG抗体阳转，或IgG抗体滴度较急性期有4倍及以上增高，均表示病人近期感染了CHIKV，
可作为病例确诊的依据。
A.3 蚀斑减少中和试验检测基孔肯雅病毒中和抗体
A.3.1 原理
血清中CHIKV中和抗体可阻断病毒吸附细胞，而未被中和的病毒仍具有感染细胞的能力，可导致单
层细胞病变、脱落等，形成一个局限性的变性细胞区，该区称之为蚀斑。在单层细胞上覆盖含有活性染
料的营养琼脂可指示蚀斑的多少。“蚀斑”是感染了病毒的细胞，病变死亡后无法被染料染上颜色，形
成空斑，而未感染病毒的细胞可被活性染料着色，通过颜色的对比可判定蚀斑量。检测血清的中和抗体
时，需用已知蚀斑滴定度的参考毒株与待检血清反应，蚀斑数减少表示血清有中和活性，中和反应后能
引起50％蚀斑减少的血清稀释度的倒数即为蚀斑减少中和抗体的滴度。蚀斑减少中和试验检测基孔肯雅
病毒中和抗体实验应在BSL-3级实验室内进行。
A.3.2 材料和试剂
材料和试剂如下：
a) 设备：4℃冰箱、37℃水浴锅、二氧化碳培养箱、无菌平底 6 孔组织培养板。
b) 易感细胞：健康单层 Vero细胞。
c) 细胞生长液：100 mL生长液中包含 Eagle's MEM溶液 88mL，10 000IU/mL青链霉素溶液 1 mL，
1％谷氨酰胺 1 mL，胎牛血清 10 mL，用 7.5％碳酸氢钠溶液调至 pH 7.2，用前混匀。
d) 细胞维持液：100 mL维持液中包含 Eagle's MEM溶液 96 mL，10 000 U/mL青链霉素溶液 1 mL，
1％谷氨酰胺 1 mL，胎牛血清 2 mL，用 7.5％碳酸氢钠溶液调至 pH 7.2，用前混匀。
e) 细胞消化液：2.5 g胰酶溶于 1 000 mL无钙镁磷酸盐缓冲液中，过滤除菌。
f) 病毒储备液及其滴定：CHIKV 接种 Vero 细胞，待细胞出现细胞病理性效应（CPE）达+++后收
获病毒，离心后将上清分装到无菌 2 mL 螺口血清管，冻存到-70℃冰箱作为病毒储备液备用。
使用前先取一支病毒液进行病毒蚀斑形成单位（PFU）滴定。具体操作步骤为：
1) 准备 3块已长成单层的 VERO细胞 6孔细胞培养板，并编号；
2) 将病毒液用维持液做连续 10 倍稀释至 10-8，弃去细胞培养液，然后从最高稀释度起将各
稀释度的病毒液加到 6 孔细胞板中，每个稀释度加两孔，每孔 0.1 mL，最后两孔作细胞
对照，37℃吸附 1 h；
3) 准备 1％琼脂培养基，并使其保温在 43℃，病毒吸附结束后加入琼脂培养基到各细胞孔，
每孔 3 mL，轻柔摇晃混匀，确保琼脂将病毒液完全覆盖，大约 20 min后，琼脂完全凝固，
将平板倒置放入 CO2培养箱中，37℃培养；
4) 每天观察计数蚀斑量，并在细胞板的背面用记号笔圈出蚀斑；如果接种 10-4稀释度的病毒
孔的蚀斑无法计数，接种 10-5稀释度病毒的两个细胞孔中平均有 100个蚀斑，那么病毒的
滴度为 10７PFU/mL。
g) 其他试剂：阳性对照血清、阴性对照血清、待测血清标本、牛血清白蛋白(BSA)、pH 7.4的 Tris
缓冲液、琼脂糖、中性红。
A.3.3 检测方法
按以下步骤操作：
a) 待检血清在 56℃水浴灭活 30 min，除去血清中的补体和其他干扰因子。
b) 用含 1％ BSA 的维持液稀释病毒至每 0.1 mL含有 200个蚀斑单位（200 PFU/0.1 mL）。
c) 用含 1％ BSA 的维持液将待检血清先做 1∶5稀释，然后做连续 2倍稀释至 1∶160或是所需要
的滴度，并保证每个稀释度的工作容量为 0.1 mL。
d) 取稀释好的 200 PFU/0.1 mL 的病毒液 0.1 mL，分别加入 0.1 mL 不同稀释度的血清中，混匀
后，4℃孵育过夜，或者 37℃孵育 1h。
e) 取稀释好的 200 PFU/0.1 mL的病毒液 0.5 mL，加入等量的含 1％ BSA的维持液混匀，然后对
病毒液做连续 10倍稀释，包括：10-1和 10-2，这些混合稀释液各自的最终病毒含量要达到 100
PFU/0.1 mL、10 PFU/0.1 mL 和 1PFU/0.1 mL，最后对病毒液做回滴，并且病毒回滴液和病毒
血清混合液在同样条件下孵育。
f) 孵育结束后，先将 6孔板中的单层细胞培养液吸出，然后加入病毒-血清混合液，每孔 0.1 mL。
用另外一块细胞培养板加入用于病毒回滴的病毒稀释液，各稀释度加两孔，37℃吸附 1 h。
g) 准备含中性红的 1％琼脂或琼脂糖培养基，加热使其完全溶解后放置 43℃水浴使其保持液体状
态备用，含有中性红染料的营养琼脂配方为：维持液中加 1％琼脂和 0.4％中性红。
h) 将上述 1％琼脂培养基逐一加入病毒血清反应孔和病毒回滴孔中，每孔加入 3 mL，轻柔摇晃混
匀，确保琼脂将病毒-血清混合液完全覆盖。
i) 大约 20 min 后，琼脂完全凝固，将平板倒置放入 CO2培养箱中，37℃培养。每天观察计数蚀
斑量，并在倒置的平板上用记号笔圈出蚀斑。
A.3.4 结果判断
结果判断规则如下：
a) 病毒回滴试验是为了确定加入的病毒量是否合适，计算病毒回滴试验中的蚀斑数，计算平行孔
中的蚀斑数平均值，只有蚀斑量在 30～100之间时才计算试验孔中的蚀斑量，最后计算中和抗
体滴度。
b) 阳性血清对照成立，测定抗体滴度在已知抗体滴度的上下一个稀释度范围内；同时检测细胞对
照孔，对照孔细胞形态正常则所做试验结果可靠。只有试验孔出现 90％的蚀斑量减少现象才
可判定出现了免疫中和反应。比如，逆滴定表明已知攻击病毒滴度为 100 PFU/0.1 mL，那么
≤10个蚀斑量的血清稀释度就是终点。
c) 能中和病毒的最高血清稀释度的倒数就是蚀斑减少中和抗体滴度。
A.3.5 意义
恢复期血清抗体滴度比急性期升高4倍或4倍以上或抗体阳转，表示病人近期感染了CHIKV，可作为
病例确诊的依据。
B B
附 录 B
（规范性附录）
基孔肯雅热病原学检测方法
B.1 基孔肯雅病毒分离与鉴定（细胞培养）
B.1.1 原理
基孔肯雅病毒（chikungunya virus，以下简称CHIKV）可感染蚊源C6/36细胞以及非洲绿猴肾细胞
（Vero）和金黄地鼠肾细胞（BHK21）等哺乳动物细胞，并引起细胞病变效应（CPE）。细胞培养分离物
可用特异性免疫荧光试验或特异性核酸扩增试验鉴定是否存在CHIKV。
B.1.2 材料和试剂
材料和试剂如下：
a) 设备：二氧化碳培养箱、生物安全柜、倒置显微镜；
b) 易感细胞：C6/36或 Vero或 BHK21；
c) 细胞消化液：2.5 g胰酶溶于 1 000 mL无钙镁磷酸盐缓冲液中，过滤除菌；
d) 细胞生长液：100 mL生长液中包含 Eagle's MEM溶液 88 mL，10 000 IU/mL青链霉素溶液 1 mL，
1％谷氨酰胺 1 mL，胎牛血清 10 mL，用 7.5％碳酸氢钠溶液调至 pH 7.2，用前混匀；
e) 细胞维持液：100 mL维持液中包含 Eagle's MEM溶液 96 mL，10 000 U/mL青链霉素溶液 1 mL，
1％谷氨酰胺 1 mL，胎牛血清 2 mL，用 7.5％碳酸氢钠溶液调至 pH 7.2，用前混匀。
B.1.3 检测方法（以Vero细胞为例）
按以下步骤操作：
a) 生长至单层的细胞管，弃去培养液，加入 200 µL 稀释好的血清标本液，每份血清标本用细胞
维持液作 1∶10、1∶100稀释，每个稀释度接种两管，置 5％CO2的培养箱中 37℃吸附 1 h（C6/36
细胞为 28℃吸附 1 h）；
b) 吸附 1 h 后吸出细胞管中的标本液，加入 1 mL细胞维持液，同时设正常细胞对照，置 5％CO2
培养箱中 37℃（C6/36细胞为 28℃）培养 7 d，每天观察是否出现 CPE；如果 7 d后仍未出现
CPE，则需再盲传 3代。
B.1.4 结果判断
CHIKV感染Vero细胞可出现典型的CPE，表现为细胞脱落、坏死、破碎等特征。但确定病毒
分离成功需经病毒特异性RT-PCR或间接免疫荧光试验对分离物或病变细胞进行鉴定。
B.1.5 意义
从病人血标本中分离到CHIKV，可作为病例确诊的依据。
B.2 基孔肯雅病毒核酸检测
B.2.1 TaqMan探针实时荧光逆转录聚合酶链反应（Real-time RT-PCR）
B.2.1.1 原理
病毒RNA在逆转录酶的作用下产生cDNA，可作为聚合酶链（PCR）扩增反应的模版。TaqMan探针实时
荧光定量PCR时，在反应体系中加入一对病毒特异性引物和一条荧光基团标记的病毒特异性探针。TaqMan
探针的两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团，在探针完好的情况下，报告基团发出的荧光信号被淬灭
基团所吸收，因而检测不到荧光信号。在PCR扩增过程中，探针和引物与目标序列结合，当新生链沿着
cDNA模板延伸到荧光标记的探针结合位点时，Taq酶发挥5′→3′核酸外切酶的功能，荧光报告基团与
淬灭基团分离，荧光基团释放荧光信号。这样模板每扩增一次，就产生一个游离的荧光分子，利用荧光
信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板可进行定量分析。其中R......
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