标准搜索结果: 'GB 5009.211-2022'
| 标准编号 | GB 5009.211-2022 (GB5009.211-2022) | | 中文名称 | 食品安全国家标准 食品中叶酸的测定 | | 英文名称 | National Food Safety Standard - Determination of folates in food | | 行业 | 国家标准 | | 中标分类 | X09 | | 字数估计 | 12,141 | | 发布日期 | 2022-06-30 | | 实施日期 | 2022-12-30 | | 旧标准 (被替代) | GB 5009.211-2014 | | 归口单位 | 国家健康卫生委员会 | | 发布机构 | 国家市场监督管理总局 | GB 5009.211-2022: 食品安全国家标准 食品中叶酸的测定
GB 5009.211-2022 英文名称: National Food Safety Standard - Determination of folates in food
书中华人民共和国国家标准
GB ５００９．２１１-２０２２
１ 范围
本标准规定了食品中叶酸的测定方法。
本标准适用于食品中叶酸的测定。
５ 菌种的制备与保存
５．１ 菌种
５．２ 储备菌种的制备
将菌种鼠李糖乳杆菌转接至菌种储备用琼脂培养基中，在３６℃±１℃恒温培养箱中培养２０ｈ～
２４ｈ，连续传种２代～３代。取出后放入２℃～４℃冰箱作为储备菌株保存。
实验前将储备菌株接种至菌种储备用琼脂培养基中，在３６℃±１℃恒温培养箱中培养２０ｈ～２４ｈ以活化菌株，用于接种液的制备。
注：保存２周以上的储备菌种，不能立即用作接种液制备，实验前宜连续传种２代～３代以保证细菌活力。
５．３ 接种液的制备
实验前一天，取２ｍＬ叶酸标准工作液与４ｍＬ叶酸测定用培养基混匀，分装至２支试管中，于
１２１℃ （０．１０ＭＰａ～０．１２ＭＰａ）高压灭菌１５ｍｉｎ（或根据培养基标签标识进行灭菌）后即为种子培养液。
冷却后用接种环将活化的菌株转种至２支种子培养液中，于３６℃±１℃恒温培养箱中培养２０ｈ～
２４ｈ。取出后将种子培养液混悬，无菌操作下吸取０．５ｍＬ转种至５ｍＬ不加叶酸标准工作液的无菌叶
酸测定培养基中，于３６℃±１℃再培养６ｈ，以消耗种子培养液中残存在菌株中的多余叶酸，制成接种液。
６ 分析步骤（所有操作均需避光进行）
６．１ 试样制备
谷物类、豆类、乳粉等试样需粉碎、研磨、过筛（筛板孔径０．３ｍｍ～０．５ｍｍ）；肉、蛋、坚果等用均质
器制成食糜；果蔬、半固体食品等试样需匀浆混匀，也可采用冷冻干燥粉碎法混匀；液体试样用前振摇混
合。上述制备的试样于２℃～４℃冰箱可保存１周。
６．２ 试样提取
６．２．１ 直接提取法
测定样品中添加的叶酸含量时，可采用直接提取法。
准确称取固体试样０．１ｇ～２ｇ或液体试样０．５ｍＬ～２ｍＬ，精确至０．００１ｇ，转入锥形瓶中，加入
８０ｍＬ氢氧化钠乙醇溶液，具塞，超声振荡０．５ｈ～４ｈ至试样完全溶解或分散，转入１００ｍＬ容量瓶中，用水定容至刻度。
６．２．２ 酶解提取法
谷薯类、肉蛋乳类、果蔬菌藻类、豆类及坚果类等食品试样中天然存在的叶酸宜采用酶解提取法。
准确称取适量试样（含０．２μｇ～２μｇ叶酸），精确至０．００１ｇ。一般谷薯类、肉类、乳类、新鲜果蔬、菌藻类试样２ｇ～５ｇ；蛋类、豆类、坚果类、内脏、干制试样０．２ｇ～２ｇ；流质或半流质试样５ｇ～１０ｇ。转入
１００ｍＬ锥形瓶中，加３０ｍＬ磷酸盐缓冲液，振摇５ｍｉｎ后，具塞，于１２１℃（０．１０ＭＰａ～０．１２ＭＰａ）高压水解１５ｍｉｎ。
试样取出后冷却至室温，加入１ｍＬ鸡胰腺溶液、１ｍＬ蛋白酶-淀粉酶液，混合。加入３滴～５滴甲
GB ５００９．２１１-２０２２
苯后，置于３６℃±１℃恒温培养箱内酶解１６ｈ～２０ｈ。取出，转入１００ｍＬ容量瓶，加水定容至刻度，过滤。
另取一只锥形瓶，不加试样，其他步骤同试样操作，作为酶空白液。
注：以谷物、乳粉等为基质的配方食品如需计量基质本底叶酸含量，可采用酶解法提取。
６．３ 稀释
根据试样中叶酸含量用水对试样提取液进行适当稀释，使试样稀释液中叶酸含量在０．２ｎｇ／ｍＬ～
０．３ｎｇ／ｍＬ范围内。
６．４ 试样测定
６．４．１ 试管法
６．４．１．１ 试样和酶空白系列管
取３支试管，分别加入１．０ｍＬ、２．０ｍＬ、３．０ｍＬ试样稀释液（犞狓），补水至５．０ｍＬ，混匀。另取３支
试管同法加入酶空白液。每个梯度做２个平行。
６．４．１．２ 标准系列管
取试管分别加入叶酸标准工作溶液０．００ｍＬ、０．２５ｍＬ、０．５０ｍＬ、１．００ｍＬ、１．５０ｍＬ、２．００ｍＬ、
２．５０ｍＬ、３．００ｍＬ、４．００ｍＬ和５．００ｍＬ，补水至５．００ｍＬ，相当于标准系列管中叶酸含量为０．００ｎｇ、
０．０５ｎｇ、０．１０ｎｇ、０．２０ｎｇ、０．３０ｎｇ、０．４０ｎｇ、０．５０ｎｇ、０．６０ｎｇ、０．８０ｎｇ和１．００ｎｇ，混。制备２套～３套
标准系列管，绘制标准曲线时，以每个标准点平均值计算。
６．４．１．３ 灭菌
将所有测定系列管、叶酸测定培养基于１２１℃（０．１０ＭＰａ～０．１２ＭＰａ）高压灭菌１５ｍｉｎ（或根据培养基要求进行灭菌）。
６．４．１．４ 接种和培养
待测定系列管冷却至室温后，在无菌操作条件下，每１０ｍＬ叶酸测定培养基加入接种液４０μＬ，混匀，每支测定管中加入接种后的叶酸测定培养基５ｍＬ，混匀。置于３６℃±１℃恒温培养箱中培养２０ｈ～
４０ｈ，获最大混浊度时终止培养。另准备一支标准０管（含０．００ｎｇ叶酸）不接种作为０对照管。
６．４．１．５ 测定
将培养好的标准系列管、试样和酶空白系列管用漩涡振荡器混匀。用１ｃｍ比色杯，于５４０ｎｍ处，
以未接种０对照管调节透光率为１００％（或吸光度值为０），依次测定标准系列管、试样和酶空白系列管
的透光率（或吸光度值）。如果０对照管出现浑浊，说明可能有杂菌污染，需重做实验。
注：适宜的测定光谱范围为５４０ｎｍ～６１０ｎｍ。
６．４．２ 微孔板法
６．４．２．１ 试样系列管
先将６．３试样稀释液无菌条件下用无菌水相滤膜（０．２２μｍ）过滤除菌，取３支１．５ｍＬ无菌离心管，分别加入１００μＬ、２００μＬ、３００μＬ试样稀释液，补无菌水至５００μＬ。每个梯度做２个平行。
GB ５００９．２１１-２０２２
６．４．２．２ 标准系列管
按６．４．１．２中标准溶液的制备方式，体积按比例缩减至１．０ｍＬ后，在无菌条件下过滤除菌至无菌离
心管中。制备２套～３套标准系列管，绘制标准曲线时，以每个标准点平均值计算。
６．４．２．３ 接种和培养
叶酸测定培养基高压灭菌冷却后，每１０ｍＬ培养基中加入菌种接种液４０μＬ，混匀，吸取１５０μＬ加入微孔板中。另吸取１５０μＬ标准系列管或试样系列管加入微孔板中，覆膜，混匀，置于３６℃±１℃恒温培养箱中培养３２ｈ～４０ｈ。
６．４．２．４ 测定
混匀微孔板中培养物，用酶标仪在５４０ｎｍ处测定吸光度值。
如果０对照孔出现浑浊，说明可能有杂菌污染，需重做实验。
注：适宜的测定光谱范围为５４０ｎｍ～６１０ｎｍ。
７ 分析结果表述
７．１ 标准曲线
以标准系列管叶酸含量为横坐标，每个标准点透光率（或吸光度值）均值为纵坐标，绘制标准曲线。
７．２ 试样结果计算
从标准曲线计算试样或酶空白系列管中叶酸的相应含量（犮狓），如果３支试样系列管中有２支叶酸
含量在０．１０ｎｇ～０．８０ｎｇ范围内，且各管之间折合为每毫升试样提取液中叶酸含量的偏差小于１０％，则
可继续按式（１）、式（２）、式（３）进行结果计算，否则需重新取样测定。
８ 精密度
一般食品在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的１５％；营养
素补充剂和强化食品在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的１０％。
９ 其他
试管法：果蔬类试样称样量为５ｇ时，检出限为０．２μｇ／１００ｇ，定量限为０．４μｇ／１００ｇ；蛋白质、淀粉含量高的试样称样量为５ｇ时，检出限为１．０μｇ／１００ｇ，定量限为２．０μｇ／１００ｇ；营养强化剂和强化食品称样量为１ｇ时，检出限为０．５μｇ／１００ｇ，定量限为１．０μｇ／１００ｇ。微孔板法：添加了叶酸的样品，称样量为１．０ｇ，稀释倍数为１时，
附 录 A
培养基配制
A．１ 菌种储备用琼脂培养基
A．１．１ 试剂
A．１．１．１ 磷酸氢二钾（Ｋ２ＨＰＯ４）。
A．１．１．２ 三水合磷酸二氢钾（ＫＨ２ＰＯ４·３Ｈ２Ｏ）。
A．１．１．３ 七水合硫酸镁（ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ）。
A．１．１．４ 七水合硫酸亚铁（ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ）。
A．１．１．５ 一水合硫酸锰（ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ）。
A．１．１．６ 三水合乙酸钠（ＣＨ３ＣＯＯＮａ·３Ｈ２Ｏ）。
A．１．１．７ 葡萄糖（Ｃ６Ｈ１２Ｏ６）。
A．１．１．８ 蛋白胨：含氮量≥１０％。
A．１．１．９ 酵母提取物（干粉）：含氮量≥１０％。
A．１．１．１０ 琼脂。
A．１．１．１１ 盐酸溶液（１ｍｏｌ／Ｌ）：量取８３．３ｍＬ盐酸（浓度３６％～３８％），用水定容至１０００ｍＬ，混匀。
A．１．２ 试剂配制
A．１．２．１ 甲盐溶液：分别称取２５ｇ磷酸氢二钾和２５ｇ三水合磷酸二氢钾，加水溶解并定容至５００ｍＬ，
混匀。加入１ｍＬ甲苯，混匀；该溶液于２℃～４℃冰箱可保存１年。
A．１．２．２ 乙盐溶液：分别称取１０ｇ七水合硫酸镁、０．５ｇ氯化钠、０．５ｇ七水合硫酸亚铁和０．５ｇ一水合
硫酸锰，加水溶解并定容至５００ｍＬ。加５滴１ｍｏｌ／Ｌ盐酸溶液，混匀；该溶液于２℃～４℃冰箱可保存１年。
A．１．２．３ 菌种储备用琼脂培养基：按表Ａ．１称量或吸取各试剂，加水至１００ｍＬ，混合，沸水浴加热至琼
脂完全溶化。趁热用１ｍｏｌ／Ｌ盐酸溶液或１ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠溶液调节ｐＨ至６．８±０．１。尽快分装，根
据试管内径粗细加入３ｍＬ～５ｍＬ，液面高度不得低于２ｃｍ。１２１℃（０．１０ＭＰａ～０．１２ＭＰａ）高压灭菌
１５ｍｉｎ。试管取出后直立放置，待冷却后于２℃～４℃冰箱内保存，备用。
A．２．２．３ 酪蛋白液：称取５０ｇ去维生素酪蛋白于５００ｍＬ烧杯中，加２００ｍＬ盐酸溶液，于１２１℃
（０．１０ＭＰａ～０．１２ＭＰａ）高压水解６ｈ。将水解物转移至蒸发皿内，在沸水浴上蒸发至膏状。加２００ｍＬ
水使之溶解后再蒸发至膏状，如此反复３次，以除去盐酸。用１０ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠调节ｐＨ至３．５±０．１。
加２０ｇ活性炭，振摇约２０ｍｉｎ，过滤。重复活性炭处理直至滤液呈淡黄色或无色。滤液加水稀释至
１０００ｍＬ，加１ｍＬ～３ｍＬ甲苯，于２℃～４℃冰箱可保存１年。
注：每次蒸发时不可蒸干或焦糊，以避免所含营养素破坏。也可直接购买效力相当的酸水解无维生素酪蛋白。
A．２．２．４ 腺嘌呤-鸟嘌呤-尿嘧啶溶液：分别称取硫酸腺嘌呤、盐酸鸟嘌呤以及尿嘧啶各０．１ｇ于２５０ｍＬ
烧杯中，加７５ｍＬ水和２ｍＬ盐酸，加热使其完全溶解后冷却。若有沉淀产生，再加盐酸数滴，加热，如
此反复直至冷却后无沉淀产生为止，加水至１００ｍＬ。加３滴～５滴甲苯，储存于棕色试剂瓶中，于２℃～４℃ 冰箱可保存１年。
A．２．２．５ 黄嘌呤（Ｃ５Ｈ４Ｎ４Ｏ２）溶液：称取０．４ｇ黄嘌呤，加１０ｍＬ氨水，加热溶解，加水至１００ｍＬ。加
３滴～５滴甲苯，储存于棕色试剂瓶中，于２℃～４℃冰箱可保存１年。
A．２．２．６ 乙酸缓冲液（１．６ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ４．５）：称取６３ｇ三水合乙酸钠，用２００ｍＬ水溶解，加大约２０ｍＬ冰乙酸调节ｐＨ至４．５±０．１，混合后，用水稀释至５００ｍＬ。
A．２．２．７ 维生素液：称取１００ｍｇ核黄素用４００ｍＬ乙酸缓冲液溶解。取２５ｍｇ碳酸氢钠溶解于
５００ｍＬ水中，加入２ｍｇ生物素、２００ｍｇ对氨基苯甲酸、４００ｍｇ盐酸吡哆醇、４０ｍｇ盐酸硫胺素、８０ｍｇ
泛酸钙、８０ｍｇ尼克酸溶解。将上述两种溶液混合，加水至１０００ｍＬ。加入３滴～５滴甲苯，储存于棕
色试剂瓶中，于２℃～４℃冰箱可保存１年。
A．２．２．８ 聚山梨酯-８０溶液（吐温-８０）：将１０ｇ聚山梨酯-８０溶于无水乙......
|